姜黃素通過促進ROS產生誘導人腦膠質瘤細胞凋亡

劉國安，靳亞東，冉苗苗，李貴琛，楊麒勵，丁 蘭

西北師范大學生命科學學院，蘭州730070

癌癥治療是當代生物醫學最嚴峻的挑戰，豐富的天然產物仍然是人們研究并尋找活性藥物的寶庫。姜黃素(curcumin，Cur)(1，7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮；diferuloylmethane)，結構式見圖1，一種脂溶性的黃色化合物，為姜科植物姜黃CurcumalongaLinn的根莖中提取到的姜黃素類化合物中含量最多的一種。姜黃粉用作香料給咖喱提供特定的風味和黃色，具有悠久的食用歷史。早期還用來治療咬傷，燒傷和粉刺等疾病[1]。近些年發現具廣泛的藥理活性。姜黃素具有抗炎活性、消除自由基、抗衰老功能及對化療藥物增敏作用等[2]，并對腫瘤血管生成和腫瘤轉移的關鍵分子有抑制作用[3]。臨床研究顯示對多種慢性疾病包括肺病，自身免疫疾病和癌癥有效[4]，其中對其抗癌活性與機理的研究較多。大部分研究發現，姜黃素的多種藥理活性與其抗氧化作用相關[5]，它可能在癌發生的各個階段起到抑制作用。但近些年大量研究發現，很多具抗氧化活性的酚類物質在一定的條件下卻表現出促氧化作用，而腫瘤細胞高代謝率引起細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)高于正常細胞。因此利用促氧化劑進一步升高癌細胞中的ROS，繼而殺死癌細胞成為治療癌癥的策略之一。本文檢測了姜黃素對人膠質瘤細胞U87的生長抑制作用，并檢測了氧化還原指標及凋亡信號通路，試圖揭示其作用機理。

圖1 姜黃素結構式

1 材料與方法

1.1 細胞

人膠質瘤細胞U87購自中國科學院上海細胞庫

1.2 試劑與儀器

DMEM培養基購自美國Gibco公司，姜黃素購自北京索萊寶科技有限公司(lot：822A025純度：99.34%)，L型谷胱甘肽購自美國Sigma公司，CCK-8和GKT137831購自AbMole公司，活性氧檢測試劑盒購自BestBio貝博生物有限公司，DCFH-DA熒光探針購自蘇州宇恒生物科技有限公司，SOD酶活試劑盒、T-AOC試劑盒、GSH/GSSG測試盒、MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。NADPH-OX(NADPH oxidase)酶聯免疫試劑盒購自江來生物科技有限公司，NF-κB/p65單抗、Caspase-3單抗和Caspase-1單抗均購自英國Abcam公司，超敏ECL化學發光試劑盒為新賽美生物有限公司生產。二甲基亞砜購自美國Merck公司，胎牛血清為杭州四季青生物科技公司生產。

超凈工作臺(蘇州蘇凈集團)，CKKX41SF倒置顯微鏡(日本東京Olympus)，IX71型熒光顯微鏡(日本東京Olympus)，基礎電泳儀(美國BIO-RAD)，多功能凝膠成像系統(美國BIO-RAD)，Coulter Allegra64R高速低溫離心機(美國Beckman)，BIO-RAD m680酶標儀(美國BIO-RAD)，細胞培養板(美國Costar)，FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養與形態學觀察

人腦膠質瘤細胞U87培養于含10%滅活小牛血清、青霉素80 U/mL及鏈霉素80 μg/mL DMEM完全培養基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養。將對數生長期的U87細胞用胰酶消化后調整細胞密度為1.5×105個/mL，接種于6孔板培養24 h，分別加入5 mmol/L谷胱甘肽(glutathione，GSH)預處理1 h后或直接加入終濃度為0、5、10、20、40 μmol/L的姜黃素的完全培養基，繼續培養24 h。倒置顯微鏡下觀察細胞形態學的變化并拍照。

1.3.2 CCK-8法檢測姜黃素對細胞增殖抑制

CCK-8法檢測活細胞數較傳統的MTT法更敏感。四唑鹽WST-8是MTT類似物，細胞線粒體脫氫酶在電子載體存在時可以將WST-8還原成高水溶性的黃色甲瓚產物，生成的甲瓚與活細胞的數量成正比，顏色深淺表示細胞數多少。檢測時U87細胞以密度10×104個/mL接種于96孔板中，貼壁培養24 h后，加入含有不同濃度姜黃素的完全培養基100 μL，培養24 h后每孔加入10% CCK-8溶液10 μL，繼續孵育4 h，酶標儀檢測450 nm吸光值。細胞生長率計算公式為：生長率=Ai/A0×100%，其中，Ai表示處理組的吸光值，A0表示空白對照組的吸光值。線性回歸分析計算半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)。

1.3.3 熒光顯微鏡檢測U87細胞內活性氧水平

將培養至對數期的U87細胞配制成濃度為1.5×105個/mL的細胞懸液，接種于六孔板培養24 h后，GSH預處理1 h或者只加入不同濃度姜黃素，繼續培養3 h后pH 7.4 PBS洗滌，加入DCFH-DA熒光探針37 ℃染色30 min，PBS洗后熒光顯微鏡檢測。

1.3.4 流式細胞術檢測U87細胞內活性氧水平

將3 mL密度為1.5×105個/mL的U87細胞接種于60 mm細胞培養皿中，處理后離心收集細胞，PBS洗滌后加入DCFH-DA，染色后收集細胞，再以PBS洗滌后經260目尼龍網過濾后上流式細胞儀檢測。

1.3.5 酶聯免疫標記檢測NADPH氧化酶活力

以1.5×105個細胞/mL接種U87細胞于6孔板，培養24 h后加不同濃度的姜黃素處理后收集細胞，反復液氮凍融使細胞破碎并釋放出細胞內容物。3 000 rpm離心20分鐘，收集上清。抗體夾心法酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒檢測，酶標儀測定450 nm處吸光值，計算樣品NADPH-OX濃度。

1.3.6 丙二醛(MDA)含量、GSH含量、細胞總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測

將細胞以1.5×105個/mL密度接種于6孔板中培養24 h，加不同濃度姜黃素處理24 h；吸去上清并用PBS洗兩遍，細胞刮下反復凍融，BCA法測定細胞樣品蛋白濃度。測定時按各試劑盒說明操作。

1.3.7 AO/EB熒光染色法檢測U87細胞凋亡

細胞以濃度為1.5×105個/mL接種于6孔板，培養24 h后分別加入姜黃素或先以GSH預處理，繼續培養24 h后收集細胞，PBS洗滌后加入AO/EB染色，于熒光顯微鏡下觀察細胞并拍照。

1.3.8 Annexin V/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡

將細胞以1.5×104個/mL密度接種于細胞培養皿中，24 h后加不同濃度姜黃素處理24 h后收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞，YF48Annexin V和PI避光孵育處理后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.9 Western blot法檢測細胞信號通路蛋白

接種于培養皿中的U87細胞經藥物處理24 h之后，用預冷的PBS清洗細胞，裂解細胞后離心取上清以BCA法測定樣品蛋白濃度。常規SDS-PAGE電泳后轉膜，封閉后一抗及二抗孵育，清洗之后的PVDF膜放于暗盒中，滴加超敏ECL(electrochemiluminescence)化學發光劑，室溫下避光60 s，凝膠圖像分析儀進行拍照。

1.4 數據統計與制圖

用SPSS數據統計軟件完成t檢驗和方差分析，實驗結果以mean±SD表示，圖片用Origin 軟件制作，化學結構式用Chemdraw繪制。

2 結果

2.1 姜黃素對U87細胞的毒性及GSH的抑制作用

CCK-8法檢測化合物作用于細胞24 h的增殖率可以看出(圖2)，姜黃素對U87細胞生長有明顯的抑制作用。5 μmol/L就表現出細胞毒性，與對照組相比，各劑量細胞增殖率均顯著降低(P<0.01)，且隨著姜黃素濃度的升高，細胞增殖率逐漸下降。姜黃素濃度在5～100 μmol/L范圍內，細胞增殖率從91.68%降至36.01%，顯示細胞生長率與姜黃素濃度有劑量依賴關系，回歸分析可知IC50=68.32 μmol/L。

顯微鏡下觀察U87細胞生長狀態及形態學變化顯示(圖3)，5 μmol/L姜黃素處理組與對照組細胞相近(圖3：A和B)。10、20、40 μmol/L姜黃素處理組細胞形態改變明顯(圖3：C、D、E)，顯示胞體兩端突起，呈收縮細胞增多，貼壁細胞減少，姜黃素濃度較高時細胞失去貼壁性，懸浮在培養基中，有些似已死亡。但10和40 μmol/L姜黃素與5 mmol/L GSH聯合處理后細胞明顯趨向正常，尤其40 μmol/L組圓形細胞明顯變少，神經突起狀細胞增多，與對照組細胞相比，無明顯的細胞形態改變。GSH是一種抗氧化劑，聯合作用后細胞受損情況減弱，貼壁細胞增多，細胞狀態恢復到與對照組相似的形態，說明GSH可能通過抗氧化抑制姜黃素引起的氧化損傷，使細胞向正常生長狀態恢復。

圖2 CCK-8法檢測姜黃素作用下U87細胞的增殖率

2.2 姜黃素處理使U87細胞ROS升高

ROS是細胞正常代謝過程中產生的包括超氧陰離子自由基等含氧的不穩定離子或小分子，參與細胞生長增殖、發育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。DCFH-DA熒光探針檢測細胞顯示，姜黃素作用后細胞內ROS升高。對照組細胞內DCF熒光發光微弱(圖4：A)表明細胞內ROS含量較低。5、10 μmol/L姜黃素處理U87細胞3 h后胞內熒光依次增強(圖4：B和C)表明ROS含量依次增高。而GSH的加入清除了胞內部分ROS(圖4：E和F)。

熒光染色后流式細胞術檢測細胞內活性氧結果也顯示姜黃素促進ROS升高。以對照組熒光強度為1時處理組相對強度見圖5，U87細胞經姜黃素(5和10 μmol/L)處理3、6 h后，ROS含量顯著上升，且10 μmol/L姜黃素處理組上升水平更顯著，是未處理細胞的2倍多。說明在6 h內姜黃素以時間-劑量依賴的方式使U87細胞內ROS水平升高。在加入抗氧化劑GSH預處理1 h組，5和10 μmol/L姜黃素組的ROS水平較姜黃素單獨處理均明顯降低。說明姜黃素可以引起ROS含量的顯著升高，而且抗氧化劑GSH減弱了這種作用。

圖3 姜黃素與GSH對U87細胞形態的影響(200×)

圖4 DCFH-DA熒光探針檢測姜黃素和GSH作用于U87細胞ROS的變化

2.3 姜黃素誘導U87細胞NADPH氧化酶活性增高

細胞中除了線粒體呼吸鏈，NADPH-OX是細胞內ROS的主要來源。當以5～40 μmol/L姜黃素作用于U87細胞后，檢測發現NADPH-OX活性逐漸升高(圖6)，10 μmol/L就顯示顯著差異。NADPH-OX抑制GKT137831的加入，使酶活性差異顯著下降。

2.4 姜黃素處理后U87細胞處于氧化脅迫

當細胞中抗氧化系統難以抵御ROS的氧化作用，氧化脅迫(oxidative stress)就會威脅到細胞的正常代謝。MDA是脂質過氧化的產物，其含量反應了細胞膜受ROS氧化損傷的程度。姜黃素處理后細胞MDA含量隨姜黃素濃度升高而增加(圖7：A)，說明5～40 μmol/L濃度的姜黃素引起細胞膜濃度依賴性氧化損傷，且自10 μmol/L起MDA即顯著、40 μmol/L時已極顯著升高。還原型GSH是細胞內重要的抗氧化因子，具有清除內源性或外源性活性氧代謝產物的作用。姜黃素作用后，GSH含量急劇下降(圖7：B)，40 μmol/L姜黃素使得GSH下降為原來的十分之一，表明姜黃素的作用使得細胞中氧化作用消耗了大量還原力。

T-AOC是包括酶和非酶系統在內的全部抗氧化物的總抗氧化能力的指標。姜黃素處理使細胞T-AOC顯著并呈濃度依賴性降低(圖7：C)。SOD是生物體內重要的抗氧化酶，可以清除超氧陰離子等超氧化物，對抗與阻斷對細胞造成的損害。如圖(7：D)所示，濃度較低(5 μmol/L)時，姜黃素處理降低了細胞SOD，表明氧化脅迫消耗了一部分酶，而濃度升高至10、20 μmol/L時酶活性升高，而40 μmol/L姜黃素處理SOD含量又降低。這可能是由于姜黃素引起的促氧化誘導了SOD的產生，高濃度的姜黃素促氧化作用過強，損傷并降低了細胞SOD活性。

圖5 姜黃素單獨及與GSH連用后3和6 h后的活性氧水平

圖6 姜黃素作用下U87細胞內NADPH氧化酶活力升高

2.5 姜黃素誘導U87細胞凋亡

熒光染色法檢測細胞凋亡的原理是，吖啶橙(acridine orange，AO)能通過細胞膜并嵌入細胞核DNA，發出明亮的綠色熒光；嗅化乙錠(ethidium bro mide，EB)只能進入細胞膜受損的細胞，嵌入細胞DNA并發出橙色熒光。熒光顯微鏡下可見活細胞核染色質呈均一綠色，早期凋亡細胞核染色質呈綠色凝聚或圓珠狀。晚期凋亡細胞呈橙色、固體或圓珠狀。非凋亡壞死細胞核染色質呈橙色。

圖7 姜黃素作用下U87細胞丙二醛水平、谷胱甘肽含量、總抗氧化能力及超氧化物歧化酶活力

姜黃素處理U87細胞24 h后，AO/EB染色的結果如圖8所示，對照組細胞核完整，顯示為綠色熒光均一的正常形態(圖8：A)；5 μmol/L姜黃素處理細胞核內出現染色質凝集，類似早期凋亡(圖8：B)；10 μmol/L姜黃素引起細胞核內出現黃色和橘紅色染色質，表明出現了晚期凋亡(圖8：C)。濃度至40 μmol/L時細胞核內出現大量的紅色染色質和部分黃色染色質，且核染色質呈固縮狀，表明出現了細胞晚期凋亡和壞死(圖8：D)。當姜黃素與5 mmol/L GSH聯合處理后，呈黃色和紅色的核染色質的細胞減少，綠色均一熒光細胞回升(圖8：E，F)。可見5～40 μmol/L姜黃素可使U87細胞凋亡，抗氧化劑GSH能減弱姜黃素誘導的U87細胞核損傷及凋亡。

圖8 AO/EB法檢測姜黃素誘導人腦膠質瘤U87細胞凋亡

Annexin V/PI雙染后以流式細胞術檢測可量化凋亡細胞。在細胞凋亡的早期階段，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)會外翻到細胞膜的外側，Annexin V可以選擇性結合PS。碘化丙啶(propidium iodide，PI)是一種DNA結合染料，可在細胞凋亡后期對壞死細胞或失去細胞膜完整性的細胞核進行染色，通過流式細胞分析可以檢測細胞的狀態。

Annexin V/PI雙染，流式細胞術檢測凋亡細胞結果如圖9所示，姜黃素處理組細胞凋亡率上升，呈現濃度依賴性，姜黃素濃度越高，U87細胞凋亡率越高。5、10、20、40 μmol/L處理后細胞總凋亡率從3.87%升高至98.70%。在10、40 μmol/L 姜黃素組加入抗氧化劑GSH聯合處理后，細胞總凋亡率分別從7.33%和98.70%下降到6.65%和70.85%，明顯減弱了姜黃素誘導的凋亡作用，進一步說明姜黃素通過促氧化誘導U87細胞凋亡。

2.6 Western blot法檢測細胞凋亡信號通路蛋白

通過Western blotting檢測凋亡相關蛋白信號通路(圖10)發現，姜黃素處理使NF-κB/p65蛋白的表達水平明顯下降，與5 mmol/L GSH共同處理后蛋白表達水平上升，表明姜黃素引起的ROS升高可以下調NF-κB/p65蛋白的表達；檢測線粒體內源性凋亡途徑中相關蛋白發現，姜黃素可以升高促凋亡蛋白Bax的表達，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，即升高Bax/Bcl-2值；并發現姜黃素誘導的細胞凋亡可能是Caspase依賴的。檢測結果顯示姜黃素下調了Pro Caspase-3的表達，說明相對增加了其激活形式的Caspase-3的量，進而誘導了細胞凋亡。加入抗氧化劑GSH檢測這些蛋白顯示，GSH均逆轉了姜黃素的作用，也說明姜黃素誘導的細胞死亡是通過促氧化作用實現的。

綜合以上各項研究結果表明，姜黃素在作用于人腦膠質瘤U87細胞后，通過提高細胞NADPH氧化酶活性而促進ROS產生，引起細胞內氧化應激指標改變，包括T-AOC降低、MDA升高、GSH下降、SOD升高，即姜黃素處理使得U87細胞處于氧化脅迫，且隨著濃度升高脅迫加重。ROS的升高，觸發了細胞信號通路，下調NF-κB/p65蛋白的表達，誘導線粒體內源性凋亡途徑中Bax和Bcl-2的差異性表達，最終通過凋亡執行分子Caspase-3使細胞凋亡。

圖9 YF488-Annexin V/PI雙染流式細胞術法檢測姜黃素與GSH誘導U87細胞凋亡

圖10 姜黃素對NF-κB、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

3 討論與結論

姜黃素是一種天然膳食多酚類化合物，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗糖尿病和促進傷口愈合等多種藥理活性。其中抗癌活性備受關注，少量動物模型的實驗也證明了姜黃素的抗癌作用。包括多名患者的65個臨床試驗也證明，姜黃素對人類健康有廣泛的有益影響[6]。構效關系研究揭示一些苯環上甲氧基的存在提高了姜黃素的活性[7]。研究表明，姜黃素是通過抗氧化抑制多種類型癌細胞生長，包括肺癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌、胰腺癌和結腸癌，但對人腦膠質瘤的研究甚少。

正常情況下ROS作為活性因子參與細胞信號傳導和轉錄。一些體內外因素會引起ROS升高，若細胞氧化-還原失去平衡產生氧化脅迫，ROS就會通過損傷DNA導致突變而作為癌發生的觸發劑。但與正常細胞相比，癌細胞有更高含量的ROS為人們提供了通過加強氧化脅迫殺死癌細胞的思路。一些抗癌藥物如紫杉醇可通過產生ROS損傷癌細胞或通過ROS干擾癌細胞代謝。甚至有些抗癌試劑如蓽茇明堿(piperlongumine)只結合于癌細胞的幾個抗氧化酶如GST和羰基氧化酶的活性位點[8]。很多文獻報道了姜黃素的促氧化作用，有研究發現姜黃素可通過提高細胞ROS及相關細胞凋亡信號誘導細胞凋亡[9]。這些似乎與姜黃素的抗氧化作用相矛盾，究其原因，是該化合物作用時的濃度和處理細胞的種類決定的，低濃度時具有抗氧化作用。如用脂多糖處理小膠質細胞(microglia，MG)，氧化指標一氧化氮和其合成酶等都升高，而抗氧化酶SOD活性降低。在較低濃度(10～20 μmol/L)的姜黃素作用下，一氧化氮和合成酶等都明顯降低，SOD活性明顯上升，表明姜黃素在此濃度下具抗氧化性[10]，與本文中姜黃素在10～20 μmol/L時對U87細胞SOD活力提升一致。當用姜黃素處理食管癌 KYSE410時，該細胞的MDA含量升高，SOD水平降低，較高濃度(40 μmol/L)引起的氧化脅迫更嚴重[11]。此外，不同種類細胞效果也不盡相同[12]。本文用姜黃素處理U87細胞，顯示姜黃素抑制U87細胞增殖、細胞活性氧水平升高、氧化脅迫增加進而引起細胞信號蛋白變化，最終誘導細胞凋亡。這些結果將為姜黃素的臨床應用提供重要數據和理論參考。