白藜蘆醇對馬凡氏綜合征動脈瘤凋亡作用機制的影響

蔡玉華，李云鵬

馬凡氏綜合征(Marfan syndrome， MFS)是一種常染色體顯性遺傳疾病，主要由原纖維蛋白-1基因(fibrillin-1 gene，FBN1)的不同突變引起結締組織結構和功能的改變，常累及主動脈形成馬凡動脈瘤而致死[1]。MFS動脈瘤的病理機制與血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的存活和死亡密切相關。研究表明可通過促進VSMCs的凋亡反應進而改善動脈瘤的過度增殖，最終減緩MFS動脈瘤病程的發生發展[2-3]。在臨床治療中，目前仍未研發出有效治療MFS動脈瘤形成的藥物，大多數MFS病人最終采用手術治療動脈瘤，但是治療效果一般[4]。因此，探討MFS動脈瘤的病理機制及藥物靶點治療研究具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 馬凡氏模型小鼠(FBN1C1039G/+)購自美國賽業生物科技有限公司，DMEM培養基、胰蛋白酶購自Hyclone公司，胎牛血清購自德國PAN公司，增殖活性檢測MTT試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天公司，兔抗鼠Bax、Bcl-2以及β-actin抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 細胞培養 鈍性分離C57野生小鼠和馬凡模型小鼠的胸主動脈，提取野生小鼠和馬凡小鼠的原代VSMCs，將各組VSMCs置于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃細胞孵育箱中，2～3 d以后換液，待細胞生長至培養皿的80%以上，采用胰蛋白酶消化傳代至新的培養皿中，將4～8代的VSMCs用于實驗檢測。

1.3 細胞分組 各組細胞生長至培養皿的80%以上，采用無血清饑餓各組細胞24 h后，根據是否采用白藜蘆醇處理，將本細胞實驗分為4組：Control組，采用含有10%胎牛血清的DMEM處理野生小鼠的原代VSMCs；Control+Resveratrol組，采用含有10%的胎牛血清的DMEM培養基+10 μm白藜蘆醇處理野生小鼠的原代VSMCs；MFS組，采用含有10%胎牛血清的DMEM培養基處理FBN1C1039G/+小鼠的原代VSMCs；MFS+Resveratrol組，采用含有10%的胎牛血清的DMEM培養基+10 μm白藜蘆醇處理FBN1 C1039G/+小鼠的原代VSMCs。將處理后的細胞培養24h后，收集各組細胞，以備后續實驗檢測相關指標。

1.4 MTT檢測細胞增殖率 將4組細胞以密度為1×104個/孔接種于96孔中，待細胞生長至80%以上，根據實驗設計處理各組細胞24 h后，每孔再加入MTT溶液10 μL，將各組細胞置于37 ℃的細胞培養箱孵育3 h后，取出各組細胞，棄培養液，加入DMSO液體孵育10 min，最后在酶標儀檢測各孔吸光度，換算各組細胞增殖率。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 將4組細胞根據實驗設計分別處理24 h，處理步驟同前。將處理后的細胞采用胰蛋白酶消化懸浮各組VSMC后，將各組細胞依次進行以下步驟：加預冷的PBS液體洗滌、離心、加入RNA酶室溫孵育30 min，加入5 μL的PI溶液，移入至流式細胞檢測管內，最后將各組細胞置于流式細胞儀下檢測，采用Flow Jo軟件分析各組細胞凋亡水平。

1.6 Western blot檢測凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達 將4組細胞根據實驗設計分別處理24 h，處理步驟同前。將處理后的細胞加入蛋白裂解液后提取總蛋白，根據BCA試劑盒說明書檢測各組細胞蛋白濃度后，再加入蛋白裂解液將各組細胞蛋白濃度調至相同。將各組蛋白依次進行電泳分離、轉膜、5%牛奶封閉2 h，最后將各組蛋白條帶與Bax、Bcl-2和β-actin的一抗置于4 ℃冰箱孵育過夜。次日將各組條帶洗滌后，再加入相應的二抗置于室溫下孵育2 h，最后于暗室加入ECL試劑盒顯影和記錄分析結果。

2 結 果

2.1 白藜蘆醇抑制馬凡動脈瘤的增殖率情況 采用MTT試劑盒檢測各組VSMCs的增殖水平，結果表明MFS組的VMSCs增殖率明顯高于Control組(P<0.05)，提示MFS小鼠的體外血管平滑肌細胞過度增殖模型建立成功。而與Control組相比，Control+Resveratrol組的VSMCs增殖率比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示白藜蘆醇對野生小鼠的VSMCs增殖水平無明顯改變。與MFS組相比，MFS+Resveratrol組的VSMCs增殖率明顯下降(P<0.05)，提示白藜蘆醇可明顯抑制MFS的VSMCs過度增殖反應。同時白藜蘆醇對普通小鼠和MFS小鼠的VSMCs增殖率差異表現，也進一步提示白藜蘆醇對MFS動脈瘤的病理機制具有一定的調控功能。詳見圖1。

與Control組比較，*P<0.05；

2.2 白藜蘆醇促進馬凡動脈瘤的凋亡率情況 采用流式細胞術檢測各組VSMCs的凋亡情況，結果表明MFS組的VMSCs凋亡率明顯低于Control組(P<0.05)，提示MFS小鼠的VSMCs凋亡水平下降進而促進動脈瘤的形成。而與MFS組相比，MFS+Resveratrol組的VSMCs凋亡率明顯上升(P<0.05)，提示白藜蘆醇可促進VSMCs的凋亡反應進而減緩動脈瘤形成。詳見表1。通過檢測各組增殖與凋亡水平發現，白藜蘆醇對MFS小鼠的VSMCs具有促凋亡和抗增殖的作用功能，具體機制仍需進一步探索。

表1 各組VSMCs的凋亡率比較(±s)

2.3 白藜蘆醇調節凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表達情況 采用Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達，結果表明，與Control組比較，MFS組的Bax的蛋白表達明顯下降(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達改變無統計學意義(P>0.05)，而Bax/Bcl-2也明顯下降(P<0.05)。與MFS組比較，MFS+Resveratrol組的Bax的蛋白表達上升(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達改變無統計學意義(P>0.05)，而Bax/Bcl-2也明顯上升(P<0.05)。提示MFS小鼠的VSMCs的促凋亡蛋白Bax表達明顯下降進而有助于MFS動脈瘤的形成，而白藜蘆醇則可明顯上調MFS的VSMCs的促凋亡蛋白Bax的表達進而促進凋亡反應，最終改善MFS動脈瘤的形成。詳見圖2。

與Control組比較，*P<0.05；與MFS組比較，#P<0.05。

3 討 論

白藜蘆醇作為天然的多酚化合物具有多重生物學效應，主要包括抗氧化、抗炎癥以及調節血脂代謝，可對機體內多個系統疾病發揮重要的藥理學意義[5-7]。而在心血管系統疾病研究中，白藜蘆醇被證實可改善心肌缺血、動脈粥樣硬化和抗心律失常等保護心血管功能的作用[8-10]。但關于白藜蘆醇對馬凡綜合征動脈瘤作用機制的研究較少，有研究證實白藜蘆醇可明顯抑制VSMCs的增殖、炎癥及氧化應激等病理過程進而改善血管損傷的發生發展[11-12]。在血管損傷中，VSMCs的凋亡與增殖常為對立關系，凋亡增強可限制增殖過度，抑制增殖過度則可促進凋亡的發生[13-14]。而MFS動脈瘤的形成也與VSMCs增殖過度和凋亡下降明顯相關[2]。基于MFS動脈瘤與VSMCs的存活與死亡密切相關，本研究通過體外培養原代VSMCs，采用白藜蘆醇處理細胞，發現白藜蘆醇可明顯抑制馬凡小鼠VSMCs的過度增殖進而改善MFS動脈瘤的形成。分析VSMCs增殖與凋亡的對立關系，進一步驗證白藜蘆醇對馬凡小鼠VSMCs的具體調控作用，檢測白藜蘆醇對VSMCs的凋亡反應影響，結果表明白藜蘆醇可明顯促進VSMCs的凋亡反應進而抑制VSMCs的增殖水平，最終改善MFS動脈瘤的形成。

而VSMCs凋亡具體作用機制可受促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2調控。研究證實Bax/Bcl-2的增加可改變線粒體膜通透性和調節細胞色素C的釋放，進而明顯促進凋亡反應[15]。因此，掌握Bax和Bcl-2之間的平衡則為調控VSMCs凋亡機制的關鍵。本研究已驗證白藜蘆醇可通過上調促凋亡蛋白Bax的表達進而促進MFS的VSMCs凋亡反應，同時也抑制VSMCs的增殖反應，最終改善MFS動脈瘤病理過程。此外，TGF-β信號通路在MFS的主動脈中明顯激活，而有效抑制TGF-β信號通路可明顯抑制MFS病人主動脈擴張[16]。已有研究驗證白藜蘆醇可通過抑制TGF-β信號通路誘導細胞凋亡反應[17]。因此，根據本實驗結果，推測白藜蘆醇可能通過抑制TGF-β信號通路進而調控VSMCs的存亡，最終改善MFS動脈瘤的形成。

綜上所述，白藜蘆醇可通過上調促凋亡基因Bax的表達進而促進VSMCs的凋亡反應，同時抑制VSMCs的增殖水平，最終可改善馬凡小鼠動脈瘤的病理發展過程。