乳桿菌計數測試片凝膠特性與顯色特性的研究

何湃，陳萍，王尹瀟，董娜,任常菲，史艷宇

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，長春130022；2.吉林省食品檢驗所，長春130012）

0 引 言

乳桿菌是一種革蘭陽性、厭氧或兼性厭氧、無芽孢桿菌，具有調節腸道菌群、增強免疫力、改善腸道功能、促進消化等作用。目前我國乳中乳桿菌計數依照GB 4789.35-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》[1]進行測定，國標的乳桿菌檢測程序較為繁瑣，所以發展便捷方法計數乳桿菌產品市場前景十分廣闊，計數測試片法是當前非常理想的檢測方法。其中以冷水可溶凝膠為載體的測試片比較先進并且應用廣泛，菌落生長良好，培養周期短，但進口測試片仍存在價格昂貴等問題，會提高檢測成本。國內幾家微生物公司近年來也陸續推出了不同類型的微生物測試片，例如以無紡布為載體和以冷水可溶性凝膠為載體的微生物測試片。雖然這些測試片便于攜帶且操作方便，但陳春田等[2]將國產測試片與傳統方法進行比較，測試片在規定培養時間內有菌落生長，但菌落數低于傳統方法且存在顯著性差異。針對上述存在的問題，本研究著重改良乳桿菌測試片凝膠特性與顯色特性，提高菌落生長及顯色效果。

本實驗室前期研究了冷水可溶性凝膠的凝膠與質構特性，發現凝膠質構對微生物生長有著非常重要的影響[3]，所以本研究著重對于乳桿菌計數測試片的凝膠特性與顯色特性進行系統研究，篩選出乳桿菌測試片最優冷水可溶性凝膠配比，為培養乳桿菌提供適宜的生長環境。并優化培養基顯色劑，對照菌落生長狀況及顯色效果篩選出顯色劑最適宜濃度，根據顯色劑與乳桿菌特異代謝物發生顯色反應的原理，使菌落顯色清晰，對乳桿菌進行鑒別和計數[4]。本研究通過對乳桿菌測試片凝膠特性和顯色特性的研究，研制出一種操作便捷，計數準確的乳桿菌測試片產品。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛肉粉、蛋白胨等，陸橋技術（北京）有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑、瓜爾膠、結冷膠、聚丙烯酸鈉、卡拉膠，西亞生化試劑發展有限公司和拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 主要儀器與設備

FA1004B型電子天平，上海精天電子儀器廠；ZDX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器鍋，上海申安醫療器械廠；Dwv.781型電熱恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；U 410型超低溫冰柜，廣州吉源生物科技有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海捷呈實驗儀器有限公司；原泰奇氣式粉碎機，北京錕捷玉誠機械設備有限公司；BROOKFIELD LFRA-4500質構儀，杭州嘉維創新科技有限公司。

1.3 試驗菌株

乳桿菌屬（Lactobacillus）CICC 10481，類干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）CICC 20241于吉林農業大學實驗室保存。

1.4 菌懸液制備

菌懸液的制備：將培養的乳桿菌單菌落接種于100 mL MRS液體培養基中，放入恒溫培養箱中于36±1℃培養48 h。取25 mL菌液加入225 mL無菌生理鹽水后混勻，制成1:10的稀釋液。取1:10的稀釋液1 mL加入9 mL的生理鹽水中，充分混勻，制成系列稀釋度菌懸液備用。

1.5 測試片制備

測試片上層膜為高透明度、無刺激性氣味、防水透氣、無毒的PET透明硅膠膜；中層支撐材料為透明度高，硬度較好，帶有鏤空區域的聚丙烯（PP）透明塑料板，厚度為0.18 mm；底層材料為印有淡橘色1×1 cm網格、防水防滲透的白色銅版紙。將上、中、下三種材質剪裁為長度9 cm，寬度8 cm，采用無毒無味的聚丙烯酸樹脂壓敏膠進行粘合，粘合寬度為5 mm；中層支撐材料PET透明塑料板與底板構成半徑為3 cm的培養區域。將培養基均勻加入到中間鏤空區域。乳桿菌計數測試片的培養基是國標MRS培養基，成分為葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉粉5 g/L、酵母粉4 g/L、吐溫-80 1.0 mL/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、醋酸鈉5 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L、2,3,5-氯化三苯基四氮唑0.08 g/L。滅菌方法采用環氧乙烷滅菌法[5]。

1.6 測試片計數方法

測試片計數方法采用GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[6]，按照國家標準規定，選取菌落數在30～300 CFU之間、無蔓延菌落生長的測試片計數菌落總數。低于30 CFU的測試片記錄具體菌落數,大于300 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個測試片菌落數的平均數。

1.7 冷水可溶性凝膠及質構特性研究

1.7.1 凝膠配制

根據本實驗室前期課題組實驗結果[7]，選取4種冷水可溶性凝膠：瓜爾膠、結冷膠、聚丙烯酸鈉、卡拉膠，復配冷水可溶性凝膠按瓜爾膠、結冷膠、聚丙烯酸鈉、卡拉膠5∶2∶2∶1比例配制。將瓜爾膠、結冷膠、聚丙烯酸鈉、卡拉膠4種凝膠劑及按上述比例配制的復配膠使用原泰奇氣式粉碎機粉碎成粉末，過120目標準篩[8]。

1.7.2 凝膠復配對凝膠及質構特性的研究

1.7.2.1 4種冷水可溶性凝膠與復配膠凝膠特性的測定按照文獻方法[9-10]對瓜爾膠、結冷膠、聚丙烯酸鈉、卡拉膠4種冷水可溶性凝膠及復配膠凝膠特性進行測定。分別測定其擴散時間、擴散速度、濁度、保水率和吸水率。將不同的膠體溶液于室溫下放置24 h，在550 nm下測定吸光度 (A) ，根據公式（1）計算透光度，以去離子水作為空白對照。同時測定1.0% 瓊脂的透光度。

式中：A=吸光度，T=透光度

稱取1.0 g凝膠粉末，放入9 cm的培養皿中，加入10 mL去離子水，待室溫條件下充分溶脹后，將多余水分過120目標準篩濾去，記錄濾液量，利用公式（2）計算復配膠的保水率，并以1.0% 瓊脂作為對照。

式中：M 1為吸水前凝膠劑和水的總質量；M 2為濾出水的質量[11]。

1.7.2.2 4種冷水可溶性凝膠與復配膠質構特性的測定對瓜爾膠、結冷膠、聚丙烯酸鈉、卡拉膠4種冷水可溶性凝膠及復配膠進行質構測定。分別測定其脆性、黏性、黏度、硬度、彈性、咀嚼性、內聚性及回彈性。參考Ramirez J.A.[12]的方法將凝固的凝膠裝入2 cm為半徑的鋁盒中，使用質構儀（BROOKFIELD LFRA-4500）測定凝膠特性，同時測定1.0% 瓊脂凝膠特性。質構儀的參數設置如下：采用P/0.5探頭，測試速度：5.0 mm／s，觸發力：5 g，壓縮比：50% 。

1.7.2.3 復配冷水可溶性凝膠與MRS培養基混合比例及質構特性的測定

配制復配冷水可溶性凝膠與MRS培養基的混合溶液，復配冷水可溶性凝膠與MRS培養基配比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5。參考D Ren[13]的方法使用質構儀測定5種配比下的質構，同時測定1.0% 瓊脂作為對照。

1.8 顯色特性研究

1.8.1 顯色原理

顯色培養基是基于目標菌中一種或多種的酶水解顯色底物使菌落本身顯色，顯色物質只沉積在菌落上而不擴散在培養基中[14]。當顯色劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑被乳桿菌細胞吸收后，能接受細胞脫氫酶中的氫，還原為一種紅色、穩定、不易擴散、不溶于水的三苯甲臜，使乳桿菌菌落顯紅色，根據其顯色效果對乳桿菌菌落數進行計數。

1.8.2 顯色劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑的劑量優化

在滅菌后的MRS培養基中分別加入0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 g/L的顯色劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑，保持其他成分不變，充分混勻配制成培養基粉末。將復配冷水可溶性凝膠粉末與MRS顯色培養基粉末按質量比3∶7配制，再將得到的混合粉末均勻涂抹在塑料中層板的培養區域內并壓實；向培養區域加入適當稀釋度的菌懸液1 mL，置于36±1℃恒溫培養箱培養48 h，觀察菌落顯色效果及菌落形態，確定顯色劑的最適添加量，評價乳桿菌測試片顯色特性。

1.9 測試片檢測性能評價

1.9.1 靈敏度檢測

將制備好的乳桿菌試驗菌株菌懸液，以無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋至10-2～10-6CFU/mL，使用測試片法和國標平板計數法對乳桿菌進行培養，對紅色菌落計數。重復試驗三次，結果取平均值，以最低稀釋度的檢測結果作為最低檢測限，以最低檢測限作為測試片靈敏度的檢測標準。檢測結果大于最低檢測限的計為陽性，結果小于最低檢測限的計為陰性，靈敏度=陽性/ (陽性+陰性) 。

1.9.2 準確度檢測

將制備好的乳桿菌試驗菌株菌懸液，以無菌生理鹽水稀釋至10-2CFU/mL，將菌懸液接種于乳桿菌計數測試片上，以國標平板培養法作為對照，將測試片和平板放入恒溫培養箱中36±1℃培養48 h，進行菌落計數。建立乳桿菌測試片法和國標平板法檢測結果的標準曲線，將試驗結果轉換為log10的值，以水平x軸作為國標平板計數法的檢測結果，垂直y軸作為測試片法的檢測結果，繪制曲線，根據相關系數判斷準確度。

1.10 數據統計和分析

試驗數據使用Origin 19.0和IBSSPSS 20.0軟件進行統計分析，各組數據均采用單因素ANOVA方差分析，設定顯著水平為P<0.05，各組試驗重復三次，取平均值。結果用平均值±標準差 (SD) 表示。

2 結果與分析

2.1 測試片凝膠特性研究

2.1.1 冷水可溶性凝膠吸水率、保水率、擴散速度等凝膠特性及質構測定

本研究選取4種適宜乳桿菌生長條件的冷水可溶性凝膠 (瓜爾膠、結冷膠、聚丙烯酸鈉、卡拉膠) 及復配冷水可溶性凝膠，分別測定吸水率、保水率、擴散速度等凝膠特性。如表1所示，對比吸水率、濁度、擴散時間。瓜爾膠吸水率為56.22 mL/g,卡拉膠為34.22 mL/g，持水性較差；聚丙烯酸鈉吸水速度過快，導致樣液不能均勻擴散，易形成結塊。以國標瓊脂做對比，聚丙烯酸鈉和結冷膠的濁度比瓊脂高，透光度較低，不利于菌落計數。擴散時間卡拉膠僅為0.2 s，擴散速度過快不易在冷水中充分水化形成平滑的膠體;結冷膠為1.2 s，擴散速度慢，不利于菌液均勻分布。復配冷水可溶性凝膠的擴散速度為0.5 s，吸水率為151.52 mL/g，保水率為89.22 mL/g，濁度為81% 。復配冷水可溶性凝膠擴散速度適中，利于菌液在培養區域的擴散；濁度較低，利于菌落計數。對比單一凝膠劑與復配膠的凝膠特性，復配冷水可溶性凝膠能夠為乳桿菌提供更良好的生長條件。

測定4種不同冷水可溶凝膠及復配冷水可溶性凝膠的質構特性，如表1所示，復配冷水可溶性凝膠質構特性為硬度2445.81、黏度-35.85、黏性672.58、回彈性0.116，與國標瓊脂對比無顯著性差異 (P>0.05) 。

2.1.2 復配冷水可溶性凝膠與MRS培養基混合比例及質構特性

通過對比按不同比例配制的復配冷水可溶性凝膠與M RS培養基混合溶液的質構特性，由表2所示，當復配冷水可溶性凝膠與MRS培養基配比為3∶7時，擴散速度為1.9 s。測定的硬度，脆性，粘著性，彈性，內聚性，膠著性，回彈性與1.0% 的瓊脂對比，無顯著性差異 (P>0.05) 。因此復配冷水可溶性凝膠可替代瓊脂作為凝膠劑應用于乳桿菌測試片中，為乳桿菌提供適宜的生長環境。

表1 冷水可溶性凝膠特性及質構測定結果

表2 冷水可溶性凝膠與MRS培養基不同配比的質構分析

2.2 測試片顯色特性研究

顯色劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑可以使乳桿菌菌落顯紅色，便于區分菌落和雜質，有利于計數。由表3所示，分別添加0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 g/L顯色劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑，48 h觀察菌落顯色效果。由圖1所示，當測試片顯色劑濃度達到0.08 g/L及以上時，菌落生長良好，顯色清晰，為節約成本選用0.08 g/L作為顯色劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑的最佳添加量，菌落顯色清晰，有效用于乳桿菌測試片的顯色計數。

表3 顯色劑濃度對菌落顯色的影響

圖1 添加不同濃度顯色劑的顯色效果

2.2.1 靈敏度檢測

進行乳桿菌測試片和國標平板培養法的對比試驗，測試片的最低檢測限為3 CFU/mL，以最低檢測限作為測試片靈敏度的檢測標準。兩種方法可達到相同水平的檢測限。對30～300 CFU/m L之間的菌落數進行分析，t=0.095，P=0.5>0.05，表明利用測試片和國標平板培養法生長的乳桿菌計數結果無差異顯著性，結果如表4。

表4 測試片靈敏度測定

2.2.2 準確度檢測

對乳桿菌測試片和國標平板培養法的結果進行對比。進行樣本獨立樣本t檢驗，t=-0.025，P=0.8>0.05，由圖2可知，R2達到0.996，具有很好的線性關系，表明兩種方法對乳桿菌的菌落計數無差異顯著性。

圖2 兩種方法的線性相關曲線

3 結 論

本研究通過測定瓜爾膠、結冷膠、聚丙烯酸鈉、卡拉膠4種適宜乳酸菌生長的冷水可溶性凝膠及復配冷水可溶性凝膠的吸水率、保水率、濁度、擴散速度等凝膠特性，復配后的凝膠擴散速度為0.5 s，吸水率為151.52 mL/g，保水率為89.22 mL/g，濁度為81% 。通過測定4種冷水可溶性凝膠及復配冷水可溶性凝膠的質構特性，復配冷水可溶性凝膠的硬度、黏度、黏性、回彈性與國標瓊脂對比，無顯著性差異 (P>0.05) 。通過測定復配冷水可溶性凝膠和MRS培養基混合后不同配比的硬度，脆性，粘著性等質構特性，確定復配冷水可溶性凝膠與MRS培養基配比為3∶7，與1.0% 的瓊脂對比，無顯著性差異 (P>0.05) 。復配冷水可溶性凝膠可應用于乳桿菌測試片中，為乳桿菌提供適宜的生長環境。

本研究通過對照試驗篩選不同濃度的顯色劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑，對比菌落生長情況及顯色效果，確定顯色劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑濃度為0.08 g/L。乳桿菌顯色培養基成分可促進乳桿菌菌落生長，使菌落顯色清晰，有效用于乳桿菌測試片的顯色計數。

本研究制備出乳桿菌顯色計數測試片，對乳中乳桿菌進行計數檢驗，菌落顯色清晰，操作便捷，計數準確，準確率達到99% ，最低檢測限達到3 CFU/mL。