產胞外多糖乳酸菌的篩選及其芒果風味發酵乳的制備

關成冉，趙瑞峰，馬雁，陶志強，黃欣媛，蘇劍波，王智斌，伍云，陸震，顧瑞霞

（1.揚州大學 江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州225127；2.廣西水牛乳工程技術研究中心，南寧530000；3.華熙生物科技有限公司，濟南250101）

0 引 言

研究表明，乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）不僅能增加發酵乳的黏度，減少乳清析出，提高發酵乳的回復性和抗剪切力[1]，還能顯著提高發酵乳的持水力[2]，是一種天然的增稠劑。EPS是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞外的粘液或莢膜多糖[3]，除了被用作食品添加劑外，還具有抗氧化[4]、降低膽固醇[5-6]、免疫調節[7]、抑制黑色素[8]形成、抗腫瘤[9]及保護腸道內的有益菌體免受毒害[10-11]等功能特性。芒果醬富含多種營養成分，同時具有獨特的風味和口感。本研究擬篩選高產EPS的乳酸菌菌株，在此基礎上優化條件，制備一款質地粘稠且具有芒果清爽香味的發酵乳，為高產EPS的乳酸菌用于發酵乳的生產提供一定的參考。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

芒果醬、蔗糖，脫脂乳粉，全脂乳粉，MRS培養基，質量分數12% 脫脂乳培養基，胰蛋白酶，酚酞、苯酚、濃硫酸、氫氧化鈉、無水乙醇、氯仿、正丁醇等均為國產分析純。

實驗菌株：植物乳桿菌S7；發酵乳桿菌BF；嗜熱鏈球菌有Y430A，937-1，g2，LPRA-3，489-1，XP1-1-1，393-2由江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室篩選鑒定。

1.1.2 儀器與設備

JF-SX-500全自動滅菌鍋，GYB60-08型高壓均質機，ZHJH-C1209B智能安全型超凈工作臺，生化培養箱，HH-6數顯恒溫水浴鍋，質構儀，酶標儀，臺式冷凍離心機，旋轉流變儀。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 菌種的活化

將-80℃冰箱的凍干菌粉用MRS培養基在37℃恒溫培養箱培養24 h，置于4℃備用。

1.2.3 乳酸菌胞外多糖的提取與測定

乳酸菌胞外多糖（EPS）的提取（粗多糖）及測定參考文獻[12]中方法，胞外多糖樣品用10 mL蒸餾水溶解，采用硫酸-苯酚法測定胞外多糖的質量濃度，用葡萄糖制作標準曲線。EPS質量濃度測定的具體方法：吸取樣品0.2 mL，加入蒸餾水0.8 mL，后加入6% 的苯酚0.5 mL和濃硫酸3.0 mL，沸水浴20 min，冷卻至室溫，用酶標儀于490 nm測吸光度，EPS質量濃度由標準曲線的回歸方程和稀釋倍數換算出。

1.2.4 制備條件對芒果風味發酵乳品質的影響

（1）不同比例混合接種量對EPS產量及發酵乳的影響。在37℃恒溫培養，發酵時間7 h，全脂乳添加量為12% ，蔗糖添加量為5% ，芒果添加量為6% ，2株乳酸菌分別按3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3的比例混合后按3% 無菌接入全脂乳中，發酵結束后置于4℃冷藏后酸化12 h，提取EPS并測定其含量，由EPS產量和感官評價選出最優的菌株配比。

（2）溫度對EPS產量及發酵乳的影響。發酵時間7 h，全脂乳添加量為12% ，蔗糖添加量為5% ，芒果添加量為6% ，將混合菌株按3% 接入配制好的全脂乳中，分別放在31，34，37，40，43℃和46℃發酵，發酵結束后置于4℃冷藏后酸化12 h，提取EPS并測定其含量，由EPS產量和感官評價選出最優的菌株配比。

（3）芒果醬的添加量對EPS產量及發酵乳的影響。在37℃恒溫培養，發酵時間7 h，全脂乳添加量為12% ，蔗糖添加量為5% ，芒果醬添加量分別為5% ，6% ，7% ，8% ，9% 和10% ，混合菌株按3% 接入配制好的全脂乳中，發酵結束后置于4℃冷藏后酸化12 h，提取EPS并測定其含量，由EPS產量和感官評價選出最優的菌株配比。

1.2.5 正交實驗優化的制備條件

為了研究菌株配比、溫度、芒果醬添加量對芒果風味發酵乳風味的影響，按照表1以菌株配比（A）、溫度（B）、芒果醬添加量（C）為變量進行正交試驗，以測定芒果發酵乳的EPS產量為試驗結果，確定制備芒果發酵乳的最佳條件。

表1 正交實試驗的因素與水平

1.2.6 測定指標及方法

發酵乳酸度、活菌數的測定按照國標規定的方法測定[13]。

1.2.7 持水力的測定

持水力測定方法如下：離心管質量m1（g），發酵乳樣品裝入離心管質量m2（g），離心15 min，轉速為3 500 r/min，去除上清液稱質量m3（g），按下式計算：

1.2.8 全質構TPA實驗參數設計

利用TMS-PRO質構儀測定樣品的硬度、黏附性、彈性和咀嚼性，設置參數為：圓柱探頭12.7 mm，觸發力0.5 N，測試速度60 mm/min，形變量50% 。

1.2.9 芒果風味發酵乳表觀黏度的測定

利用Malvern Kinexus Pro旋轉流變儀，選用CP2/50 SR 0162 SS錐板，參照王娜[14]對樣品的觸變性和表觀黏度進行測定，并略作改動。在恒溫25℃、恒定剪切速率1.0 s-1條件下，剪切時間為2 min，每10 s收集1個數據點，檢測樣品的表觀黏度與時間的關系。

1.2.10 芒果風味發酵乳感官評價

由12位研究生對芒果風味發酵乳進行感官評分。采用10分制，感官評定具體標準如表2所示。

表2 芒果發酵風味乳感官評分標準

1.2.11 數據分析

采用SPSS 25軟件和Origin 2107分別進行分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 芒果風味發酵乳發酵菌株的篩選

2.1.1 葡萄糖標準曲線

根據硫酸-苯酚法測定多糖的含量，用葡萄糖繪制標準曲線，結果如圖1所示。得出標準曲線的回歸直線方程為y=0.0098x-0.02046，R2=0.9968，胞外多糖的濃度可根據稀釋倍數和標準曲線方程換算出。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.1.2 發酵乳發酵菌株的篩選

為了篩選出高產EPS的乳酸菌菌株，提取并測定9株乳酸菌EPS的質量濃度，結果如圖2所示，9株乳酸菌EPS的產量質量濃度都大于100 mg/L，其中EPS產量最高的菌株為S7，其EPS產量是產量最低菌株LPRA-3產量的2.7倍；篩選出EPS產量最高的5株乳酸菌依次為S7，BF，Y430A，937-1和g2。

圖2 不同乳酸菌EPS產量

把進一步將這5株乳酸菌用于發酵產酸特性研究，結果如圖3所示。由圖3可以看出，937-1和S7發酵6 h即可凝乳，凝乳時間少于其他3株菌；同時，這兩株菌發酵產酸的速度顯著大于其他3株乳酸菌，因此選用937-1和S7作為芒果風味發酵乳的混合發酵劑。

2.2 單因素實驗確定EPS的制備條件對品質的影響

2.2.1 不同比例的混合發酵劑對EPS產量及發酵乳的影響

為了確定芒果風味發酵乳中發酵劑的最適配比，將937-1和S7按照不同的比例混合，測定不同比例的混合乳酸菌EPS的產量，結果如圖4所示，EPS產量最高的菌株配比為2∶1，其產量是最低配比產量的1.5倍，同時該比例所生產的發酵乳感官評分也最高，因此選擇此配比的混菌用于芒果風味發酵乳的制備。

圖3 不同乳酸菌的發酵產酸特性

圖4 不同乳酸菌菌株配比的EPS產量

2.2.2 發酵溫度對EPS產量及發酵乳的影響

為了確定芒果風味發酵乳的最佳發酵溫度，測定乳酸菌在不同的發酵溫度下EPS的產量，并進行感官評分，結果如圖5所示，7種溫度下EPS的產量都大于600 mg/L，在37℃發酵時EPS產量最高；在49℃發酵時，EPS產量最低，可能是溫度過高導致細胞活力不足從而使EPS合成減少。結合感官評價，選擇37℃為芒果風味發酵乳的發酵溫度。

圖5 不同培養溫度下的EPS產量

2.2.3 芒果醬添加量對EPS產量及發酵乳的影響

測定不同的芒果醬的添加量對發酵乳EPS產量影響，結果如圖6所示，可以看出EPS的產量隨著芒果醬的增加而升高，當芒果醬的添加量為10% 時，EPS的產量降低，同時發酵乳感官評分開始下降，口感偏甜，這可能是芒果醬自身具有一定的甜度，導致發酵乳過甜，芒果醬添加量為9% 時，EPS的產量和感官評分都達到最高，EPS產量最高，發酵乳口感細膩，酸甜適宜，無乳清析，因此，芒果醬的添加量為9% 。

圖6 不同芒果醬添加量下的EPS產量

2.3 正交實驗優化制備條件

為優化芒果風味發酵乳的制備條件，對發酵菌株配比、發酵溫度及芒果醬添加量進行正交實驗，結果如表3所示。由表3可以看出，各因素的主次關系為A（菌株配比）＞B（溫度）＞C（芒果醬添加量）；因素A顯著影響發酵乳的感官評分和EPS的產量，因素B對發酵乳的感官評分和EPS產量的影響次于A，因素C對發酵乳的感官評分和EPS產量無顯著影響；從k值得出芒果風味發酵乳制備最佳條件為A2B1C2，即菌株配比為2∶1，溫度為37℃，芒果醬的添加量為8% ，此時EPS質量濃度最高，達到834.0 mg/L；芒果風味發酵乳組織狀態均勻，乳白色中帶些淡黃色，具有芒果的清爽香味，口感細膩，酸甜可口。

表3 正交實試驗結果

2.4 貯藏期間酸度和活菌總數的變化

測對芒果風味發酵乳貯藏期間酸度（圖7a）和活菌數（圖7b）的變化進行測定，發酵乳的酸度隨著貯藏時間的延長而增大，在貯藏12 d內，酸度上升較快，由68.9°T增加到86.7°T，之后緩慢增加，18 d時酸度達到92.6°T。活菌數隨著貯藏時間的延長呈先上升后下降的趨勢，在貯藏10 d內，活菌總數逐漸上升，由8.2×108mL-1增加到9.1×108mL-1，貯藏10 d后，芒果風味發酵乳的活菌數迅速減小，18 d時活菌數減少到7.4×108mL-1，但依然大于國標中對活菌數的要求（1×106mL-1）。貯藏9 d后活菌數逐漸減少可能是隨著酸度的增加p H值下降，低p H值條件不利于乳酸菌的生長甚至導致乳酸菌的死亡。

圖7 發酵乳貯藏期間的酸度和活菌數的變化

2.5 貯藏過程中的持水性

測定芒果風味發酵乳在貯藏過程中的持水性，結果如圖8所示。在貯藏14 d內持水性由55.8% 增加到61.2% ，這可能是乳酸菌產生的EPS增加了發酵乳的持水性，減少了乳清析出。產EPS的發酵乳含有相對大的孔，EPS在這些微孔里使蛋白質網絡形成更厚由更濃密的蛋白質凝膠所形成的凝膠通道，這種結構更有利于防止發酵乳脫水析出[15]；在14 d后，發酵乳中酪蛋白構成的凝膠網狀立體結構變得疏松，引起蛋白質膠體分子團之間的作用力減弱，使酪蛋白膠體結合水含量減少[16]，從而導致發酵乳的持水力有輕微的下降。

圖8 發酵乳儲藏過程中持水性變化

2.6 貯藏過程中質構變化

圖9 發酵乳儲藏過程中質構變化

測定儲藏過程中芒果風味發酵乳的質構，包括硬度（圖9a）、黏附性（圖9b）、彈性（圖9c）和咀嚼性（圖9d）。隨著貯藏時間的延長，發酵乳硬度由開始的0.278 N減少到0.160 N，彈性由26.90 mm增加到34.12 mm，黏附性由0.723 mJ減少到0.313 mJ，咀嚼性由開始的5.95 m J減少到4.36 m J。硬度是使物體發生形變所需要的力，彈性表示物體在外力作用下發生形變，當撤銷外力后恢復原來狀態的能力，EPS的存在會阻礙了酪蛋白之間的相互作用，從而降低發酵乳的凝膠強度，提高發酵乳的彈性[16]；而咀嚼性是硬度和彈性綜合作用的結果，隨著貯藏期的延長而下降。

2.7 貯藏過程中的表觀黏度

黏度是流體食物（如發酵乳、飲料）的一個重要特性，它會影響流體食物的口感和質地[17]。選取0，6，12 d和18 d的樣品進行分析（圖10）。4組樣品都隨著剪切時間的延長，剪切速率的逐漸增大，表觀黏度逐漸下降，最后趨于平穩，表現出非牛頓流體特性，即黏度隨著剪切速率的增大而減小的假塑性和切稀現象。剛開始時，剪切速率較小，發酵乳內部的凝膠結構未被完全破壞，隨著時間延長，剪切速率增大，發酵乳內部的凝膠結構被破壞，使網絡結構內的靜電力、疏水力之間的相互作用被減弱[18-19]，表現出切稀現象。貯藏過程中，表觀黏度在12 d時達到最大，18 d表觀黏度稍有降低，但依然大于第6 d的表觀黏度，說明制備的芒果風味發酵乳在貯藏期間的穩定性較好。

圖10 發酵乳儲藏過程中表觀黏度變化

3 結 論

本研究從實驗室9株乳酸菌中篩選出2株高產EPS且發酵特性適宜的乳酸菌用于芒果發酵乳的制備，利用單因素實驗、正交實驗設計及感官評定確定芒果風味發酵乳的制備條件。當菌株S7與937-1的配比為1∶2，發酵溫度為37℃，芒果醬的添加量為8% 時，制備的芒果風味發酵乳中EPS的產量高達834.0 mg/L，發酵乳口感順滑、酸甜適宜，有特殊的芒果香味；在貯藏20 d后，芒果風味發酵乳的酸度達到92.6°T，活菌數達到9.1×108mL-1，遠高于國標中發酵乳的活菌數1×106mL-1。