發酵乳中乳酸菌的分離鑒定及特性

付文雯，朱影，羅彤，邵翠翠，黃坤，劉艷，李詩瑤，馬弋

（湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，武漢430000）

0 引 言

乳酸菌是發酵葡萄糖，主要代謝終產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱[1]，其中大部分種類被認為是安全的，可以參與體內眾多的生理代謝活動，如緩解乳糖不耐癥、降低膽固醇、改善免疫功能、抗氧化以及抑制某些病原體的黏附[2-3]。除此之外，乳酸菌對重金屬，如鉛、鎘、銅等在具有良好的吸附能力[4]，可以減少重金屬在機體中的蓄積，減輕重金屬危害。

乳酸菌在自然界中種類繁多，分布廣，在乳制品、肉制品、水果、蔬菜及植物制品上均分離出過乳酸菌，有些種類的乳酸菌甚至存在于人體的口腔、胃腸中[5-6]。因此，深入開展乳酸菌的研究，不僅在菌種獲取方面具有切實可行的現實條件，而且對保障食品安全、提高食品營養價值方面也具有重要的現實意義。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

M RS瓊脂培養基，北京陸橋；乳酸桿菌肉湯培養基，青島海博；牛膽鹽，青島海博；氯化鈉，（分析純）；HCL，（分析純）；氫氧化鈉，（分析純）等。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計，日本日立；MALDI-TOF MS基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜，德國Bruker科技有限公司；p H計，上海儀電科學儀器股份有限公司；恒溫培養箱，賽默飛世爾科技 (中國) 有限公司）；冷凍離心機，德國Sigma公司；電感耦合等離子體質譜，ICP-MS美國珀金埃爾默；電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；高壓滅菌器，日本TOMY。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

稱取25 g樣品，置于225 mL生理鹽水中，均質后，取一環在MRS平板上劃線，平板置36℃厭氧培養24～48 h。觀察菌落形態，大小。

對不同形態的菌落，分別各挑取一環劃MRS平板進行分離純化，再置36℃培養24～48 h，上基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）進行鑒定。

1.3.2 MALDI-TOF MS對純化的微生物進行鑒定

挑取單菌落，用無菌棉簽涂抹于MALDI靶點上 (每株菌涂抹5靶點) ，覆蓋1μL的HCCA基質溶液，室溫干燥后，將靶板放入儀器進行檢測。

1.3.3 乳酸菌耐膽鹽實驗

將目標菌活化2代，37℃條件下靜置培養24 h，然后以2% 的接種量接入至含有質量濃度為0.1g/100m L，0.2 g/100mL，0.5 g/100mL，0.7 g/100mL，1.0 g/100mL膽鹽的乳酸桿菌肉湯培養基中，于37℃恒溫靜置培養，16 h取樣，用紫外分光光度計測定600 nm波長處的OD值。

1.3.4 乳酸菌的耐酸試驗

將目的菌株活化2代，37℃條件下靜置培養24 h，然后以2% 的接種量接入至p H值 為2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，6.8，7.0乳酸桿菌肉湯培養基，在37℃溫度下靜置培養，用紫外分光光度計測定600 nm波長處的OD值。

1.3.5 氯化鈉耐受試驗

將目的菌株活化2代，37℃條件下靜置培養24 h，然后以2% 的接種量接入至分別含質量分數分別為0% ，2% ，4% ，6% ，8% ，10% 氯化鈉的乳酸桿菌肉湯培養基，于37℃恒溫靜置培養，16 h取樣，用紫外分光光度計600 nm波長處的OD值。

1.3.6 乳酸菌鉛吸附實驗

在15 mL無菌離心管中加入質量濃度100mg/L鉛離子水溶液1.0 mL，再分別加入不同體積菌懸液（質量濃度50 g/L），使鉛離子水溶液中的菌體終質量濃度分別達到0.5，1，1.5，2，2.5，5，10，25 g/L；最后用肉湯培養基定容至10 mL。恒溫培養 (37℃) 60 min，取吸附液離心 (14 000 r/min,5 min) 獲得上清液，稀釋后使用ICP-MS測定其中鉛離子含量。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離與鑒定

從發酵乳中分離出2株革蘭氏陽性菌，分別命名為Z1，S1。兩株菌均為表面光滑、邊緣整齊、大小不一的圓形菌落，其中Z 1為乳白色，S1為白色略為透明。將兩株菌分別挑取單菌落純化后，利用M ALDI-TOF MS獲得兩株菌的特異性蛋白質指紋圖譜，并對圖譜中蛋白質標識峰信息與標準數據庫進行多重比較，其中Z 1為植物乳桿菌的鑒定分值為2.040，S1為鼠李糖乳桿菌的鑒定分值為2.097，均屬于比較可信的鑒定結果。兩株菌的質譜圖分別如圖1和圖2所示。

圖1 植物乳桿菌飛行時間質譜圖

圖2 鼠李糖乳桿菌飛行時間質譜圖

2.2 乳酸菌耐膽鹽實驗結果

將菌液接種在不同膽鹽濃度的肉湯培養基中培養16 h后，以不含菌體、不含膽鹽的肉湯培養基為空白，在OD600nm下，測定吸光度。以膽鹽濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，畫折線趨勢圖，如圖3所示。由圖3可以看出，兩株菌均隨著膽鹽濃度的升高呈下降的趨勢，但S1菌株的下降趨勢較Z1明顯。S1菌株在0～0.1g/100 mL階段下降趨勢最快，（0.1～0.2g）/100 mL 次之，0.2g/100 mL以后逐漸趨于平緩，說明S1菌株的生長對膽鹽非常的敏感。Z1菌株從整體上看下降的都比較平緩，在（0.2～0.5 g）/100 m L下降趨勢相對最大，隨后趨于平衡，說明0.5 g/100 mL膽鹽濃度可能是Z 1菌株的一個耐膽鹽的臨界點。從整體趨勢上來看，Z 1菌株較S1菌株耐膽鹽，Z 1菌株在膽鹽濃度為1.0 g/100 mL的肉湯培養基中，相對不含膽鹽的空白管，其OD值僅下降38% ，S1菌株在膽鹽質量濃度為0.1 g/100 mL時，相對不含膽鹽的空白管其下降率就為63% ，在膽鹽質量濃度為0.2 g/100 mL時，下降率就達93% ，基本快趨于不生長。

膽鹽耐受能力是益生菌的重要特性之一，有助于益生菌通過胃腸環境并在腸道定殖（正常情況下，人體腸道中的膽鹽質量分數約為0.3% ～0.5%[7]），只有當足夠數量的活菌成功在大腸定植，乳酸菌才能發揮其益生作用[8]。Z1菌株在膽鹽質量濃度為1.0 g/100 mL條件下，也表現出良好的耐受性，對于后期將其作為添加劑應用于產品空間很大。

圖3 兩株菌在不同膽鹽質量濃度培養基中培養16 h后的OD 600 nm值

2.3 乳酸菌耐酸實驗結果

將菌液接種在不同pH值肉湯培養基中培養16h后，以不含菌體的肉湯培養基為空白，在OD600nm下，測定吸光度。以p H值為橫坐標，吸光度值為縱坐標，畫折線趨勢圖，如圖4所示。

圖4 兩株菌在不同pH值培養基中培養16 h后的OD 600值

由圖4可以看出，隨著p H值的升高，兩株菌液的吸光度均表現出先升高后下降的趨勢，均在6.8為最高點，其中S1隨著p H值的升高，上升的趨勢高于Z 1。在p H為4.5的肉湯培養基中，S1和Z1相對生長最旺盛p H值條件下菌體OD值，其相對生長率分別為52% 和62% ，表現出一定程度的耐酸性。

2.4 乳酸菌氯化鈉耐受試驗結果

將菌液接種在含不同質量分數氯化鈉肉湯培養基中培養16 h后，以不含菌體、不含氯化鈉的肉湯培養基為空白，在OD600nm下，測定吸光度。以氯化鈉的質量分數為橫坐標，吸光度值為縱坐標，畫折線趨勢圖，如圖5所示。許多發酵食品的生產中會經常使用NaCl作為主要配料，所以乳酸菌對NaCl的耐受能力會對其在含鹽發酵食品中的應用造成影響[9]。從圖上我們可以看到S1菌株在氯化鈉質量分數從0～2% 過程中，有一個迅速增長的過程，說明低鹽可以促進S1菌株的生長，但當質量分數大于2% 后，又急速的下降，在質量分數大于4% 后S1菌株就基本不生長了。Z 1菌株則表現出完全不一樣的特性，它在沒有氯化鈉存在的環境中生長的最好，隨著氯化鈉質量分數的增加生長逐漸受到抑制，在0～2% 階段下降速率最快，最后在質量分數大于6% 后基本不生長了。

圖5 兩株菌在不同質量分數氯化鈉培養基中培養16 h后的OD 600值

2.5 乳酸菌鉛吸附實驗結果

因ICP-MS靈敏度高，檢出限低[10]，為防止樣品污染儀器，上機前將樣品稀釋1 000倍，并按照樣品中鉛溶液含量，配制標準曲線質量濃度為5，10，20，40，50 μg/mL；標準曲線如圖6所示，相關系數為0.9992，現性良好。

圖6 鉛溶液標準曲線

圖7 兩株菌在不同菌體初始質量濃度下對鉛吸附能力

兩株菌在不同初始菌體濃度條件下，對鉛吸附率結果如圖7所示。由圖7可以看出，S1菌株的吸附能力整體高于Z1菌株。其中，S1菌株對鉛的吸附能力，隨著菌體濃度的增加吸附率呈現出先升高后下降的規律。菌體對鉛離子良好的耐受能力可能與其細胞表面結構、吸附能力以及對鉛離子的外排能力有關[11]。當菌體質量濃度逐漸增加時，溶液中與鉛結合的活性位點也相應增多，表現出吸附率升高，但是當菌體質量濃度大到一定程度，菌體之間相互吸附成團，造成活性結合位點減少，反而使單位吸附量降低，吸附率下降[12]。而且細菌體內重金屬含量高了之后，也會對其細胞產生毒性，抑制其生長代謝，改變細胞結構，甚至致死，一定程度上也會影響微生物對重金屬的結合量和結合率。由圖7可以看出，在菌體質量濃度為1.5 g/L時達到最大，然后開始逐漸下降，在質量濃度為5 g/L時趨于穩定。Z 1菌株的吸附率變化不是很規則，在質量濃度為0.5 g/L和5 g/L時分別達到最大吸附量。

3 結 論

本研究從自然發酵的酸奶中分離出2株細菌，經MALDI-TOF MS鑒定為植物乳桿菌（Z1）和鼠李糖乳桿菌（S1），并對其部分生化特性做了分析。結果表明，S1菌株耐酸、嗜低鹽、不耐膽鹽，對鉛有一定吸附能力；Z1菌株耐酸、耐膽鹽、耐鹽，對鉛有一定的吸附作用。通過對兩株菌特性的了解，后期可以結合基因工程技術，對細菌DNA進行人為干預，培育出具有特殊功能的乳酸菌，并將其廣泛應用于環境中重金屬的處理，或者作為食品添加劑應用于功能食品的開發，具有很強的社會效益。Zhai Qixiao等[13]將植物乳桿菌（L.plantarum）CCFM 8610用于去除水果汁和蔬菜汁中的鎘，2 h時的去除率為67% ～82% ，并利用此菌株開發出了一款酸豆乳產品，能有效緩解慢性鎘暴露對小鼠造成的毒性損傷[14]。不過將乳酸菌做成微生物制劑應用到食品或者環境中還需進一步探索，進行更加全面和深入的研究。