嬰幼兒配方乳粉和谷類輔助食品中生物素含量的測定

盧蘭香，薛霞，公丕學，魏莉莉，武傳香，丁一，王駿，祝建華，劉艷明

(山東省食品藥品檢驗研究院，濟南250101)

0 引言

生物素 (biotin) 又稱維生素B7，維生素H，化學結構中包括一個羧基側鏈 (含5個碳原子) 和兩個五元雜環[1]，是一種雙環化合物。在體內由側鏈上的羧基與酶蛋白的賴氨酸殘基ε-NH 2結合，發揮輔酶作用。生物素參與蛋白質、脂肪和糖類的代謝是維持人體正常機能與代謝活動不可或缺的B族水溶性維生素之一[2]。生物素可能有8種不同的異構體，但只有D-生物素具有生物活性，而且GB14880-2012《食品安全國家標準食品營養強化劑使用標準》[3]中也規定了生物素的添加形式為D-生物素。

文獻報道[4-5]人體腸道微生物可以合成一些生物素，所以成年人體內極少缺乏生物素；但由于嬰幼兒腸道功能較弱無法合成，且嬰幼兒飲食種類單一，所以易導致生物素缺乏。嬰兒若缺乏生物素會造成嚴重的神經癥狀[6]，出現躁狂、嗜睡、發育遲緩，以及舌炎和皮炎[7]等癥狀，因此需在嬰幼兒食品中強化生物素。嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品是嬰幼兒食品中兩大類重要食品，食品安全國家標準GB 10765-2010[8]、GB 10767-2010[9]和GB 10769-2010[10]中對生物素的添加量作了明確的規定，因此生物素也成為嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品中的必檢項目。所以準確測定嬰幼兒食品中生物素含量對于生產企業控制生物素強化劑量和政府監管提供有力的技術支撐。

生物素的測定方法很多，主要包括微生物法[7，11-12]、酶聯免疫法[13]、分光光度法、熒光分光光度法[14]、熒光免疫層析法[15]、生物傳感器法[16]、毛細管電泳法[17]、液相色譜法[18-21]、液相色譜質譜聯用法[22-26]等。其中，酶聯免疫法專一性強，但試劑價格昂貴；生物傳感器法重現性差；分光光度法靈敏度低；熒光法可靠性存在缺陷；毛細管電泳法樣品的微量制備和電滲的控制存在困難；高效液相色譜法是通用方法，但由于生物素無典型的紫外和熒光發色團，不適合含量比較低的樣品。微生物法是應用比較普遍的生物素測定方法，它是美國官方分析化學家協會 (Association of Official Analytical Chemists，AOAC) 的推薦方法和我國國標GB 5009.259-2016[12]的分析方法，方法靈敏度較高，成本較低，但是此法具有檢測周期長、樣本間平行性不好、菌種保存困難、操作復雜等缺點。嬰幼兒食品成分復雜，所添加的生物素含量極低，一般在幾微克/100克到幾十微克/100克之間。液相色譜質譜聯用法靈敏度高、選擇性強等特點，尤其結合固相萃取對樣品進行凈化，對于基質復雜且生物素含量低的樣品具有獨特的優勢。

本研究針對嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品基質復雜和生物素含量低的特點，擬采用液相色譜串聯質譜法，結合固相萃取凈化，并采用內標法定量以消除基質效應及前處理過程帶來的偏差，以期建立嬰幼兒配方乳粉和谷類輔助食品中生物素含量的分析方法。

1 實驗

1.1 試劑與材料

D-生物素標準物質，生物素-d2標準物質。甲醇、乙腈（色譜純），美國Fisher公司；甲酸（色譜純），美國Sigma-Aldrich公司；氮氣（>99.999% ），硫酸、乙酸（優級純），國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司。嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品均購自于當地超市。

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm,1.7μm) ，美國Waters公司；QASIS PRiME HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL），美國Waters公司；有機微孔濾膜（0.22μm），上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

ACQUITYTM超高效液相色譜儀和Xevo TQ-S質譜儀配有電噴霧（ESI）電離源和MasslynxTM色譜工作站，美國Waters公司；超聲波清洗器，寧波新芝生物科技有限公司；MS3渦旋混合器，IKA公司；N-EVAP-45位氮吹儀，美國Organomation公司；SQP-電子天平，塞多利斯科學儀器有限公司；Milli-Q超純水系統，美國Millipore公司。

1.3 標準溶液的配制

D-生物素標準儲備液（100μg/mL）：準確稱取5 mg（精確至0.1 mg）生物素標準品于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液（50% ）定容刻度。儲存于棕色玻璃瓶中，-20℃密封保存1年。

D-生物素標準中間液（100 ng/mL）：取適量1.00 mL生物素標準儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇溶液（50% ）稀釋并定容至刻度；然后甲醇溶液（50% ）逐級稀釋到100 ng/mL，儲存于棕色玻璃瓶中，2℃～4℃保存1個月。

生物素-d2標準儲備液（100μg/mL）：準確稱取5 mg（精確至0.1 mg）生物素-D2于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液（50% ）定容刻度。儲存于棕色玻璃瓶中，-20℃密封保存1年。

生物素-d2標準中間液（2μg/mL）：吸取2.00 mL生物素-d2標準儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液（50% ）稀釋并定容至刻度，儲存于棕色玻璃瓶中，2℃～4℃保存1個月。

標準系列工作液配制：準確吸取生物素-d2標準中間液75μL、D-生物素標準中間液適量于10 mL容量瓶中，以初始流動相配制成質量濃度為0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL的標準系列工作液，現用現配。

1.4 樣品制備

粉末狀樣品經混勻后，直接取樣；片狀、顆粒狀樣品，經樣本粉碎機磨成粉，儲存于樣品瓶中避光保存。立即測定或4℃冰箱保存，1周內測定。

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取

1.5.1.1 嬰幼兒配方乳粉

稱取1 g (精確到0.001 g) 嬰幼兒配方乳粉試樣于50 mL離心管中，，加入375μL生物素-d2標準中間液，加入約25 mL 45℃～50℃的水，置于超聲波中超聲提取約25 min以上，并冷卻至室溫。待試樣溶液降至室溫后，用鹽酸溶液調節試樣溶液的p H至1.7±0.1，放置約2 min后，再用氫氧化鈉溶液調節試樣溶液的pH至4.5±0.1，然后超聲約10 min。將試樣溶液轉移至50 mL容量瓶中，用水沖洗比色管，洗液合并于50 mL容量瓶中，用水定容至50 mL，經濾紙過濾，待凈化。

1.5.1.2 嬰幼兒谷類輔助食品

稱取1 g (精確到0.001 g) 粉碎均勻的嬰幼兒谷類輔助食品試樣于50 mL比色管中，加入375μL生物素-d2標準中間液，加入25 mL的0.1 mol/L硫酸溶液充分搖勻，在121℃下水解30 min，冷卻至室溫后，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至4.5±0.2后，再超聲約10 min。將試樣溶液轉移至50 mL容量瓶中，用水沖洗比色管，洗液合并于50 mL容量瓶中，用水定容至50 mL，經濾紙過濾。濾液再經0.22μm水相微孔濾膜過濾后上機測定。

1.5.2 凈化

將QASISPRiME HLB固相萃取柱連接到固相萃取裝置上，取1.5.1.1的樣品提取溶液1 mL于15 mL離心管中，加入1 mL 3% 乙酸溶液，渦旋混勻后上樣，然后分別用3 mL水和3 mL 5% 甲醇溶液淋洗，最后用1 mL乙腈-甲醇 (9:1，V/V) 洗脫，45℃氮吹至近干，用1 mL初始流動相復溶，經0.22μm有機相微孔濾膜過濾后上機測定。

1.6 分析條件

1.6.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm,1.7μm) 美國Waters公司；流速：0.3 mL/min；流動相：0.1% 甲酸溶液（A）和乙腈（B）；柱溫：40℃；進樣量：5μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 HPLC梯度洗脫程序

1.6.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源 (ESI) ；離子化模式：正離子模式（ESI+）；毛細管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：30 V；脫溶劑氣溫度450℃；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣流速：850 L/h：錐孔反吹氣流速：150 L/h；碰撞氣流速：0.12 mL/min；采集模式：多反應監測 (MRM) ；生物素的定性離子定量離子對及質譜參數見表2。

表2 生物素的質譜參數

1.7 基質效應評價

實驗通過分別測定純溶劑與樣品提取液中添加同水平同位素內標的峰面積響應值，計算二者的相對比值來評價基質效應 (Matrix effect）。Matrix effect factor (MEF,% )[27]=（A-B）/A×100，其中MEF為基質效應因子，A為純溶劑中內標物質的峰面積響應值，B為樣品提取液中內標物質的峰面積響應值。MEF為0表示無基質效應，絕對值越大基質效應越強，在-15% ～15% 之間，表示基質效應影響不明顯。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 樣品提取方式的優化

生物素是一種水溶性維生素，嬰幼兒配方乳粉和谷類輔助食品均含有蛋白質，所以在提取目標物的同時需去除蛋白質。參考文獻[23-24]和標準[12]，對于嬰幼兒配方乳粉中水溶性維生素主要有等電點沉淀和酸水解兩種方式去除蛋白質。嬰幼兒谷類輔助食品由于配方中主要原料是一種或多種谷物（如：大米、小米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、玉米等），對于這類產品，樣品中不但含有蛋白質還有淀粉，文獻報道[28]和標準[12]中，主要有先酶解再用等電點沉淀、酸水解、酸水解后再酶解三種方式來沉淀蛋白質和提取目標物。本研究分別考察了不同提取方式對于蛋白質沉淀效果和生物素提取的影響。

2.1.1.1 嬰幼兒配方乳粉

考察了等電點沉淀和0.1 mol/L硫酸溶解后在121℃下水解30 min的提取效果（見表3）。

研究發現，兩種提取方式，蛋白質沉淀效果都比較好，濾液均一透明，均可順利通過濾膜。由表3可見，對回收率和精密度的影響沒有明顯差異；基質效應都在15% 以下，影響較小。由于等電點沉淀操作相對簡單，而嬰幼兒配方乳粉中蛋白質以乳清蛋白 (等電點為pH 1.7) 和酪蛋白 (等電點pH 4.5) 為主，所以實驗選擇調p H 1.7和pH 4.5沉淀蛋白。

表3 不同提取方式對嬰幼兒配方乳粉中回收率、精密度和基質效應的影響 (n=6)

2.1.1.2 嬰幼兒谷類輔助食品

考察了不同的酶解、酸水解及其組合模式對嬰幼兒谷類輔助食品中生物素的提取效果（圖1）。具體考察條件如下：

（a）樣品中加入45℃～50℃的水溶解混勻后，加入0.1 g淀粉酶和0.1 g木瓜蛋白酶，在55℃下酶解30 min后冷卻至室溫，調節試樣溶液的p H至1.7±0.1，放置約1 min后，調節pH至4.5±0.1；

（b）樣品用0.1 mol/L硫酸溶解后在121℃下水解30 min，調節試樣溶液的p H至4.5±0.1；

（c）樣品經與b相同的方式水解后，加入1 mL蛋白酶-淀粉酶液（分別稱取0.2 g淀粉酶和0.2 g木瓜蛋白酶，加入20 mL水混勻），在36℃±1℃下酶解16 h。

圖1 不同提取方式對嬰幼兒谷類輔助食品中生物素提取的影響

由圖1可見，對于嬰幼兒谷類輔助食品，酶解方式生物素的含量 (圖1，A) 和回收率 (圖1，B) 偏低，而硫酸水解和硫酸水解之后酶解結果無明顯差異。

原因可能是嬰幼兒谷類輔助食品主要原料是谷物，生物素主要以與蛋白質相結合的形式存在，酶解不能完全釋放生物素，只能通過高溫下酸水解釋放；所以a酶解方式提取嬰幼兒谷類輔助食品中的生物素含量和回收率偏低。而b和c兩種提取方式都經過了高溫水解，因此結果差異很小。

圖1，C表明，b酸水解的提取方式比有酶參與的a和c基質效應小。原因可能是酶解時，樣品中蛋白質和酶自身產生了大量的肽段，干擾了質譜分析，造成離子的抑制或增強，導致基質效應大。

綜合考慮樣品中生物素的提取效率、基質效應和檢驗周期，實驗選擇硫酸水解的提取方式。

2.1.2 凈化條件的選擇

嬰幼兒配方乳粉和谷類輔助食品成分復雜，通常含有大量的蛋白質、脂肪和磷脂。在樣品前處理過程中，蛋白質通過水解沉淀被去除，但脂肪和磷脂會隨著目標物成分一起被提取出來。這些共提取物會干擾生物素的測定，影響生物素的離子化過程，降低其離子化效率，從而影響分析的準確性；同時還會污染儀器和色譜柱。因此實驗考慮采用固相萃取柱對樣品進行凈化。

2.1.2.1 固相萃取柱的選擇

由于生物素的結構包括兩個五元雜環和一個含5個碳原子的羧基側鏈，所以適合反相吸附劑的固相萃取柱進行凈化。而QASISPRiME HLB固相萃取柱是美國Waters公司在Oasis HLB技術基礎上開發出的新型固相萃取反相吸附劑[29]，無需活化和平衡，操作步驟簡單。因此實驗選用QASISPRiME HLB固相萃取柱凈化樣品。

2.1.2.2 樣品提取液酸度的影響

由于生物素化學結構中含有一個戊酸側鏈，其水溶液呈弱酸性pH值約為4.5，所以使用QASIS PRiME HLB固相萃取柱凈化時，樣品提取液的酸度可能會影響生物素在固相萃取柱上的保留。實驗以生物素-d2峰面積響應值為參考，考察了上樣前在樣品提取液中加入1 mL 3% 乙酸溶液調節酸度和不加1 mL 3% 乙酸溶液固相萃取柱對生物素保留的影響（圖2）。

圖2 樣品提取液酸度的影響

實驗表明，加入1 mL 3% 乙酸溶液后生物素-d2峰面積響應值是沒加1 mL 3% 乙酸溶液的4至8倍，樣品提取液的酸度對于固相萃取柱對生物素的保留影響比較大。原因是加入1 mL 3% 乙酸溶液后，生物素主要以分子狀態存在，極性較弱，上樣時能很好地保留在固相萃取柱上；沒加1 mL 3% 乙酸溶液時生物素主要以離子狀態存在，有較強極性，在固相萃取柱上保留較弱，上樣和淋洗過程流失了大部分目標物。所以實驗選擇上樣前加入1 mL 3% 乙酸溶液增加固相萃取柱對生物素的吸附。

2.1.2.3 凈化方式的選擇

由于嬰幼兒配方乳粉主要以乳類及乳蛋白制品為主要原料，而嬰幼兒谷類輔助食品主要原料是一種或多種谷物，二者基質差異較大；所以實驗以基質效應為參考，考察了使用QASISPRiME HLB固相萃取柱凈化和不使用QASISPRiME HLB凈化對嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品凈化效果的影響。

圖3 樣品經固相萃取柱凈化和不凈化對基質效應的影響

由圖3可見，對于不同樣品，使用QASISPRiME HLB固相萃取柱凈化和不凈化對基質效應的影響差異比較大。嬰幼兒配方乳粉凈化和不凈化基質效應影響較大，凈化前基質影響較大，凈化后基質效應影響不明顯；嬰幼兒谷類輔助食品凈化和不凈化都在-15% ～15% 之間，無明顯基質效應。

原因可能是，嬰幼兒配方乳粉基質比較復雜，含有大量的蛋白質、脂肪和磷脂，不凈化時，共提取物較多，基質效應明顯；而QASISPRiME HLB是一種新型固相萃取反相吸附劑，比較適合去除樣品中的蛋白、鹽、磷脂等基質干擾物[29]，凈化后有效去除了此類干擾物對生物素測定的影響，降低了基質效應。對于嬰幼兒谷類輔助食品主要成分是谷物，基質相對簡單，凈化和不凈化基質效應影響都不明顯。

所以實驗選擇使用QASISPRiME HLB固相萃取柱凈化嬰幼兒配方乳粉，而嬰幼兒谷類輔助食品提取后直接上機測定。

2.2 分析條件的優化

2.2.1 色譜條件的優化

實驗比較了Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1×100 mm，1.7μm) 和Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm) 兩種色譜柱分離效果和基質效應的差異。結果發現，兩種色譜柱分離效果都比較好，但是BEH C18生物素峰面積響應值更好且基質效應比T3小。所以實驗選擇BEH C18色譜柱。

流動相組成能夠影響目標化合物的分離、峰形和離子化效率，在相同的梯度洗脫條件下，分別比較了乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-10 mmol/L甲酸銨（含0.1% 甲酸）、乙腈-0.1% 乙酸、乙腈-10 mmol/L乙酸銨（含0.1% 乙酸）、甲醇-0.1% 甲酸五種流動相在BEH C18色譜柱上對目標化合物分離情況、靈敏度、峰形的影響。結果表明，有機相為甲醇時生物素峰面積響應值低、雜峰較多且分離不好；當有機相為乙腈時，0.1% 甲酸和10 mmol/L甲酸銨（含0.1% 甲酸）生物素峰面積響應值與0.1% 乙酸和10 mmol/L乙酸銨（含0.1% 乙酸）相比較高，但流動相中添加乙酸銨對色譜峰峰形及靈敏度沒有明顯促進作用，所以選擇乙腈-0.1% 甲酸為流動相。

2.2.2 質譜條件的優化

質譜條件下，生物素在電噴霧正離子化方式下，主要生成[M+H]+準分子離子峰，將100 ng/mL的D-生物素和生物素-d2混合標準溶液直接注入質譜儀，調節毛細管電壓和錐孔電壓得到響應較強的質量數245.3作為母離子。然后對母離子進行子離子掃描，調節碰撞能量，選擇響應較高的2個子離子作為定性定量離子。其中響應高質量數227.0的作為定量離子，另質量數97.0作為定性離子，優化確定質譜條件（見表2）。

2.3 基質效應考察

在液相色譜串聯質譜的應用中基質干擾效應最為常見，液相色譜-串聯質譜中的基質效應產生的原因一般認為是由于基質中的非揮發性組分與待測物質，在霧滴表面離子化的過程中產生競爭，影響電噴霧接口處的離子化效率。同位素內標與目標物具有相同的化學性質和保留時間，是液相色譜串聯質譜技術中消除基質干擾、提高定量準確度最有效的方法，因此實驗采用同位素內標來消除基質干擾實現準確定量。實驗發現，嬰幼兒配方乳粉和谷類輔助食品生物素的MEF值都在-15% ～15% 之間，基質效應影響不明顯。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍

將1.3步驟配制的標準系列工作液按濃度由低到高依次測定，以D-生物素質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標，D-生物素與生物素-d2峰面積之比（AD-生物素/A生物素-d2）和生物素-d2質量濃度的乘積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線（圖4）。結果顯示，在0.5～25 ng/mL范圍內，線性回歸方程為Y=1.04308x+0.0133202，R2=0.9975以上，線性關系良好。

2.4.2 檢出限和定量限

按1.5前處理方法處理后，測試其信噪比，分別確定定量限和檢出限。以信噪比S/N≥10得到目標物的定量限 (LOQ) ，以信噪比S/N≥3得到目標物的檢出限 (LOD) 。生物素的LOD為0.75μg/100g，LOQ為2.5μg/100g。方法檢出限、定量限均低于食品安全國家標準GB 5009.259-2016。可用于含量較低的樣品中生物素定性定量分析。

2.4.3 回收率和精密度

圖4 生物素標準曲線

圖5 標準溶液（10 ng/mL）的MRM和TIC色譜圖

向嬰幼兒配方配方食品和嬰幼兒谷類食品中分別添加3個不同質量濃度的標準溶液進行回收率實驗，各個水平平行測定6次，計算加標回收率和相對標準偏差，結果見表4。該方法的回收率為96.7% ～101.4% ，相對標準偏差為2.29% ～5.40% ，可見方法的回收率高，重現性好。對乳粉質控樣品NIST SRM 1849a樣品進行檢測，測定結果為1.90 mg/kg，在標定值 (1.99±0.13 mg/kg) 的偏差范圍內。

表4 方法的回收率和精密度 (n=6)

2.5 實際樣品檢測

應用本方法對市售的標示含有生物素的嬰幼兒配方乳粉（10份）和嬰幼兒谷類輔助食品（10份）進行分析。結果表明，生物素含量分別為嬰幼兒配方乳粉13.2～38.3μg/100g、嬰幼兒谷類輔助食品2.5～31.9 μg/100g。此方法可用于嬰幼兒配方乳粉和谷類輔助食品中生物素含量的檢測。

3 結論

本研究針對嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品兩種不同基質的樣品，比較了不同提取方式和凈化方式對生物素的提取和凈化效果的影響；建立了液相色譜-串聯質譜法測定嬰幼兒配方乳粉和谷類輔助食品中生物素含量的分析方法。

實驗選擇嬰幼兒配方乳粉采用等電點沉淀方式提取生物素，而嬰幼兒谷類輔助食品使用硫酸水解提取生物素；嬰幼兒配方食品采用QASISPRiME HLB固相萃取柱凈化，而嬰幼兒谷類輔助食品基質相對簡單無需凈化。實驗采用同位素內標法定量，降低基質效應的影響和校正前處理過程生物素損失帶來的偏差；并利用質譜的高選擇性，獲得了穩定良好的測定結果。

本方法前處理過程簡單，分析周期短、靈敏度高、精密度高、定性定量準確，適合于嬰幼兒配方乳粉和谷類輔助食品中生物素含量的測定。本研究對于生產企業監控生物素強化劑量、正確標示含量水平具有重要意義，也可為政府監管提供有力的技術支持。