促睡眠酸乳的制備及其功能評價

王平，周海燕，曾萬鈞，李院，何赟，李志成

(1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌712100；2.西安銀橋乳業（集團）有限公司，陜西 臨潼710600)

0 引言

快節奏的生活使加班熬夜、生活不規律的人群日益增多。人們長期處于一種較緊張的狀態下，就很容易導致失眠的發生[1]。長期失眠會嚴重影響患者的社交、學習、工作和認知等日間功能，降低患者的生活質量及幸福感。

酸棗仁為鼠李科植物酸棗（Ziziphus jujuba Mil1.var。spinosa (Bunge) Huex H.F.Chou）的干燥成熟種子[2]，具有補肝、寧心、斂汗和生津作用，臨床用于虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗、津傷口渴等癥[3]。酸棗仁在鎮靜、安眠、抗驚厥、降血脂等方面有很好的功效，已廣泛應用在藥品和保健食品中[4]。酸棗仁始載于《神農本草經》，列為上品，其后在歷代文獻中均有記載，如《名醫別錄》中“酸棗仁療心煩不得眠”。實驗表明酸棗仁能抑制中樞神經系統的活動，起到鎮靜、催眠的作用，能加強并穩定延長巴比妥類藥的催眠作用[5]。茯苓（Poria cocos (Schw.) Wolf.）為多孔菌科臥菌屬真菌的干燥菌核，味甘淡，性平，有健脾補中、安心養生、利水滲濕的功效，我國食用茯苓已有長達千年的歷史[6]。陳春霞研究證實羧甲基茯苓多糖注射液具有催眠作用，能增強硫噴妥鈉對小鼠中樞的抑制，使小鼠翻正反射消失持續時間顯著增長，而且可以增強麻醉效果[7]。

五味子為木蘭科植物五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill）的干燥成熟果實。五味子含有豐富的有機酸、維生素、類黃酮、植物固醇及五味子素等木酚素，能益氣強肝、增進細胞排除廢物的效率，具有鎮靜、催眠作用[8]。

百合（lilium spp.）為百合科百合屬植物。百合干為百合的干燥肉質鱗葉，具有解毒、養陰潤肺、理脾健胃、寧心安神等功效[9]。所選材料酸棗仁、茯苓、百合與五味子均是藥食兩用的材料。

目前，促睡眠產品主要是中藥復方口服液[10]，藥食兩用的促睡眠酸乳未見報道。酸乳因其營養價值高、風味獨特受到普遍歡迎。本試驗的目的是獲得酸棗仁和茯苓、五味子、百合干的提取物，添加到酸乳中制備促睡眠酸乳，然后，通過動物試驗評價其促睡眠功能，為促睡眠酸乳的工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

保加利亞桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus），西北農林科技大學食品科學與工程學院保存；牛奶（蛋白質3.04±0.16% ，脂肪3.26±0.10% ，糖4.41±0.13% ），購于西北農林科技大學試驗農場；酸棗仁、茯苓，五味子，百合干購于醫藥超市；實驗動物為SPF級昆明小鼠，體質量20～25 g。生產許可編號為SCXK (陜) 2014-002，實驗許可編號為SYXK (陜) 2004-001。小白鼠和飼料均購自購于第四軍醫大學實驗動物中心，飼料為標準的小鼠全價顆粒飼料。試驗期間，室溫22℃+2℃，相對濕度為55% ～68% 。

1.2 儀器設備

L5紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；TGL-16G型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；PB-10 p H計，德國Sartorius公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；SB-5200DT超聲清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；YX-DHS-II隔水式電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸棗仁提取物提取方法比較試驗

（1）水提法：選擇顏色、形態正常的酸棗仁，炒至鼓起，色微變深，碾碎，加入10倍量的純凈水，浸泡30 min，90℃加熱提取30 min后用濾布過濾，于濾渣中加10倍量的純凈水重復提取30 min，合并濾液，50℃真空濃縮到相當于原藥1 g/mL，即得酸棗仁提取物。

（2）醇提法：將微炒的酸棗仁碾碎，加入8倍量體積分數80% 的食用酒精，回流提取1 h，濾布過濾，于濾渣中再加8倍量的食用酒精回流1 h，過濾，合并濾液，真空濃縮至1 g/mL，即得酸棗仁提取物。

牛乳中分別添加上述兩種方法提取的酸棗仁提取物，參照陳文碩等[11]的方法制作酸乳樣品，比較酸乳的感官品質，以確定酸棗仁適宜的提取方法。

1.3.2 促睡眠酸乳的制備

（1）茯苓、五味子與百合干提取物的制備。分別選擇顏色、形態正常，干爽的茯苓、五味子與百合干，其中茯苓需切碎如大豆粒大小，然后分別加入10倍量的純凈水，室溫 (20～25℃) 浸泡30 min，參照酸棗仁水提物的制備方法制備茯苓、五味子與百合干提取物[8-9]。

（2）促睡眠酸乳配方確定。參照陳文碩等[11]的方法，配料時加入酸棗仁和或茯苓、五味子、百合干混合提取物（茯苓、五味子與百合干的質量比為 (1∶1∶1）制備促睡眠酸乳。根據預試驗和有關資料[11]在確保功能的前提下設計正交試驗表（見表1），獲得促睡眠酸乳的配方。

表1 促睡眠酸乳配方的正交試驗的因素與水平

1.3.3 感官評定方法

感官評定由有品評經驗的老師和同學共10人組成，評價指標包括色澤、滋味和氣味及組織狀態[12]。

1.3.4 酸度測定

按照GB 5413.34-2010《食品安全國家標準乳和乳制品酸度測定》進行[13]。

1.3.5 促睡眠酸乳功能評價

購買昆明小鼠60只，小鼠自由攝食和飲水，適應性喂養3 d后，剔除個體質量異常者，選取50只隨機分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ共5組，每組10只，雌雄各半，分別標號、稱重，試驗前小鼠個體質量差異不顯著。其中Ⅰ組為生理鹽水對照組，灌胃生理鹽水；Ⅱ組為普通酸乳對照組，灌胃普通酸乳；Ⅲ組為普通酸乳+茯苓、五味子、百合干混合提取物組，灌胃普通酸乳+茯苓、五味子、百合干混合提取物；Ⅳ、Ⅴ組為普通酸乳+酸棗仁和茯苓、五味子、百合干混合提取物組，即促睡眠酸乳組，分為低、高兩個劑量組。

根據人和小鼠的體表面積比例計算Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組灌胃促睡眠酸乳的量分別為12.5、12.5和25.1 g/kg，分別為人體臨床等效劑量的2倍和4倍[14]，普通酸乳組灌胃普通酸乳12.5 g/kg，Ⅱ-Ⅳ組用生理鹽水按照成品酸乳：灌胃酸乳=1:1.6稀釋，Ⅴ組旋轉蒸發儀45℃濃縮為原體積的0.8倍，使Ⅰ-Ⅳ組灌胃劑量均為0.2 mL/10g小鼠體質量。試驗開始后對每只小鼠每周稱重1次，調整灌胃劑量，連續灌胃14 d。于末次灌胃30 min后每只小鼠按體質量腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉。各組以灌胃后小鼠翻正反射消失為入睡指標，計算入睡時間，以其翻正反射恢復為小鼠的蘇醒指標，記錄各組小鼠的睡眠時間。

1.4 數據處理

用SPSS22.0分析軟件進行數據處理，結果以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 酸棗仁提取物提取方法比較

由表3可知，添加醇提法酸棗仁提取物所制備的酸乳顏色較深，口感粗糙。而添加水提法酸棗仁提取物生產出的酸乳風味、色澤和口感均比較好，綜合考慮，酸棗仁有效成分適宜提取方法為水提法。

2.2 促睡眠酸乳配方確定

以酸棗仁提取物添加量、茯苓-五味子-百合干混合提取物添加量、穩定劑添加量、菌種接種量為因素進行正交試驗，以酸度和感官評價為指標，確定促睡眠酸乳的配方，結果見表4。

由表4極差分析可知，各因素對酸乳產酸影響的大小順序依次為：茯苓、五味子、百合干混合提取物添加量＞菌種接種量＞酸棗仁提取物添加量＞穩定劑添加量。由處理2、3、5、6、8、9得知，隨著茯苓、五味子、百合干混合提取物量的增加，酸度明顯下降。由處理1、2、7、8可以看出，隨接種量的加大，酸度明顯加強。各因素對感官品質影響的大小順序為：酸棗仁提取物添加量＞接種量＞茯苓、五味子、百合干混合提取物添加量＞穩定劑添加量，酸棗仁提取物添加量對產品口感影響最大。綜合產酸能力和感官評價得出最佳工藝水平組合為A2B1C2D3。根據正交試驗結果與分析，可知最佳工藝為：酸棗仁提取物添加量10.0% ，茯苓、五味子、百合干混合提取物添加量7.0% ，接種量4.0% ，穩定劑添加量0.2% 。據此工藝生產的促睡眠酸乳，凝固性好，無乳清析出，酸味柔和，酸甜適口，風味良好。

表4 促睡眠酸乳工藝配方的正交試驗結果

2.3 促睡眠酸乳功能評價

2.3.1 促睡眠酸乳對小鼠體質量的影響

表5顯示，各組小鼠的初始體質量差異無統計學意義（P＞0.05），即小鼠的初始體質量對試驗結果幾乎沒有影響；試驗結束時，各組小鼠的體質量差異不顯著（P＞0.05），即試驗樣品對小鼠組間體質量增長基本無影響。但從表5可以看出，與生理鹽水對照組 (I) 相比，普通酸乳對照組 (Ⅱ) 、普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) 和促睡眠酸乳低、高劑量組 (Ⅳ、Ⅴ) 小鼠試驗末期的體質量有減輕趨勢，雖然差異不顯著（P＞0.05），至少說明飲用促睡眠酸乳不會增肥。

2.3.2 促睡眠酸乳對小鼠睡眠質量的影響

由表6可知，生理鹽水對照組 (Ⅰ) 小鼠的入睡時間與普通酸乳對照組 (Ⅱ) 和普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) 相比差異不顯著（P＞0.05），但與促睡眠酸乳低、高劑量組 (Ⅳ、Ⅴ) 相比差異極顯著（P＜0.01）。促睡眠酸乳低、高劑量組 (Ⅳ、Ⅴ) 小鼠的入睡時間與普通酸乳組 (Ⅱ) 相比差異顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）。就入睡時間來說，普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) ＜普通酸乳對照組 (Ⅱ) ＜生理鹽水對照組 (Ⅰ) ，但差異不顯著，說明普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) 和普通酸乳組 (Ⅱ) 均有一定的促進睡眠的作用，普通酸乳與茯苓、五味子、百合干混合提取物有一定的協同作用；普通酸乳與酸棗仁和茯苓、五味子、百合干混合提取物有良好的協同作用，并呈現出一定的劑量效應關系，低、高劑量組的促睡眠酸乳能顯著減少小鼠的入睡時間，因此具有良好的促睡眠作用。

由表6亦可知，生理鹽水對照組 (Ⅰ) 小鼠的睡眠時間與普通酸乳對照組 (Ⅱ) 相比差異不顯著（P>0.05），但與普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) 和促睡眠酸乳低、高劑量組 (Ⅳ、Ⅴ) 相比差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）。普通酸乳對照組 (Ⅱ) 的睡眠時間與普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) 相比差異顯著（P<0.05），與促睡眠酸乳低、高劑量組 (Ⅳ、Ⅴ) 相比差異極顯著（P<0.01）。普通酸乳對照組 (Ⅱ) 小鼠的睡眠時間稍高于生理鹽水對照組 (Ⅰ) ，但差異不顯著（P>0.05），說明普通酸乳也有一定的促進睡眠的作用。普通酸乳+混合提取物組 (Ⅲ) 能顯著延長小鼠的睡眠時間，說明普通酸乳與茯苓、五味子、百合干混合提取物之間有協同作用。促睡眠酸乳低、高劑量組 (Ⅳ、Ⅴ) 能極顯著延長小鼠的睡眠時間，說明酸乳與酸棗仁和茯苓、五味子、百合干混合提取物有良好的協同作用，促睡眠酸乳具有顯著的促睡眠作用。

表5 促睡眠酸乳對小鼠體質量的影響

表6 促睡眠酸乳對小鼠睡眠質量的影響

失眠可以從形態的變化及延長戊巴比妥類或其他鎮靜藥的睡眠時間上反映出來。失眠主要是由高級中樞神經系統紊亂導致，表現為大腦皮層的抑制轉換與興奮功能失調。1969年，Arpa等[15]提出5-羥色胺（5-HT）失眠學說，得到廣泛認可。后來Vgontzas等[16]通過進一步研究發現，失眠可能與下丘腦-垂體-腎上腺軸的晝夜激活有關。蔡定芳等[17]通過研究發現大鼠注射皮質酮后下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺軸被抑制的同時下丘腦單胺類遞質含量升高，與其有關的中樞神經遞質如5-HT等可基本反映這一過程。本試驗結果與該理論一致，從以下幾方面分述。

酸棗仁的化學成分豐富，目前已從酸棗仁中分離得到達瑪烷型三萜皂苷、黃酮類化合物、生物堿等活性化學成分[18]。Jiang等[19]對酸棗仁中的皂苷、黃酮和多糖進行了鎮靜催眠作用的比較，發現黃酮和皂苷均能顯著縮短小鼠的運動時間，降低小鼠協調運動能力，并延長巴比妥鈉誘導的睡眠時間。Li等[20]研究發現酸棗仁皂苷（主要是酸棗仁皂苷A和B）和酸棗仁黃酮（主要是斯皮諾素）是酸棗仁中發揮鎮靜催眠的活性物質。祝凌麗[21]也通過研究發現斯皮諾素是通過5-羥色胺系統，并作為5-HT1A受體阻斷劑，作用于突觸前和突觸后5-HT1A受體，從而增強戊巴比妥的催眠作用。

茯苓中含有茯苓多糖成分具有鎮靜作用[22]。茯苓有效成分的小鼠試驗表明，茯苓多糖對小鼠中樞神經可以產生抑制作用，從而延長麻醉時間[23]。張榮標等[24]通過研究復方酸棗仁茯苓口服液對小鼠睡眠的改善作用，發現復方酸棗仁茯苓口服液對小鼠睡眠具有改善作用，其中酸棗仁與茯苓成分具有協同作用，與本研究結果一致。

五味子具有明顯的鎮靜作用。有研究表明，五味子提取物能減少小鼠自主活動，延長巴比妥睡眠時間、抑制動物攻擊行為，對抗電休克和化學性驚厥，作用與安定藥相似[25]。王春梅[26]等通過研究發現五味子多糖能明顯減少小鼠自主活動次數，增加閾下劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠的只數，縮短小鼠睡眠潛伏期和顯著延長小鼠睡眠時間，表明北五味子多糖具有鎮定、催眠及抗焦慮作用。

百合主要活性物質為甾體皂苷類、酚酸甘油脂類和生物堿類等，多用于治療虛煩驚悸、失眠多夢、精神恍惚[27]。Wang等[28]通過相關性研究發現百合的鎮靜催眠作用與其總皂苷及薯蕷皂苷具有明顯的相關性。李峰杰等[29]通過研究發現百合還能夠顯著縮短戊巴比妥鈉及氯苯丙氨酸致失眠模型動物的睡眠潛伏期，表明百合具有較好的鎮靜催眠作用。

牛乳中含有較多的色氨酸和微量的嗎啡物質[30]，這些物質都有一定的鎮靜催眠作用[30]，特別是色氨酸，它是大腦合成5-羥色胺的主要原料[32]。5-羥色胺是大腦神經細胞分泌出一種使人欲睡的神經遞質，對大腦睡眠起著關鍵作用，且無任何副作用，因此喝牛奶有利于人們的休息和睡眠[33]。將牛乳加工成酸乳后，由于乳酸菌對蛋白質有降解作用，色氨酸含量明顯增加，還會產生促進睡眠的活性肽[34]。Sawada等[35]對參加尸體解剖課程的健康男性研究表明，服用乳酸桿菌4周可顯著改善其焦慮、抑郁情緒和整體睡眠質量。而且酸乳營養價值高于消毒牛乳或滅菌生乳，B族維生素可增加10% ～15% 。因此可以說明酸乳比牛奶具有更好的促進睡眠作用。因此，酸乳與酸棗仁及茯苓、五味子、百合干混合提取物之間有協同作用。

3 結論

利用酸棗仁、茯苓、五味子、百合干提取物與牛乳為主要原料，經發酵制得一種凝固性好、無乳清析出、酸味柔和、酸甜適口、風味良好的促睡眠酸乳，其中酸棗仁提取物、茯苓+五味子+百合干混合提取物、穩定劑最佳添加量分別為10.0% 、7.0% 、0.2% ，質量比為1∶1的保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌的最佳接種量為4.0% 。同時就促睡眠酸乳對小鼠睡眠質量影響的研究表明，酸乳與酸棗仁及茯苓、五味子、百合干混合提取物之間有良好的協同作用，并呈現出一定的劑量效應關系。促睡眠酸乳組具有鎮靜催眠作用，可以滿足人們對高效，無毒副作用的新型功能性乳制品的需要,市場前景廣闊。