一例湖羊纖維素性肺炎的病理組織學觀察

張 樺 魏 勇 王 利*

(1.西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，成都 610041； 2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，成都 610041； 3.四川省畜牧科學研究院 獸醫研究所，成都 610066)

湖羊為牛科綿羊屬飼養動物，是我國一級保護地方畜禽品種。其為太湖平原重要的家畜之一，主要分布于浙江嘉興和太湖地區。因具有成熟早、多胎、肉質好、毛皮珍貴、耐高溫高濕等特點，在四川等地區廣泛養殖[1]。羊鏈球菌病是由鏈球菌引起的一種急熱性傳染病，俗稱“嗓喉病”、“大膽病”[2]。該病在羊群中傳播速度快、致死率高，往往呈現地方性流行，分為最急性、急性、亞急性和慢性4 種類型[3-5]。鏈球菌是羊鏈球菌病的病原，也是一種人獸共患病致病菌，其所引起的豬鏈球菌病被我國農業農村部列為二類動物傳染病[6]。綿羊和山羊感染鏈球菌可引起纖維素性肺炎等呼吸道疾病和全身性的敗血癥，主要癥狀為喉嚨和下額淋巴結腫大、結膜充血、排出帶有血液的糞便[3-5]。牛感染鏈球菌可致肺炎和乳腺炎，鏈球菌性肺炎臨床癥狀可表現為呼吸急促，肺部存在摩擦音，有較多的分泌物從口鼻流出；乳腺炎表現在病牛乳房腫大，乳液分泌減少或停止[7-9]。鏈球菌病不僅對養殖業造成極大的危害和經濟損失，還影響公共衛生安全，雖然國內已有不少相關研究，但僅局限于臨床診斷和防控治療，對具體病理學診斷極少。因此，為探明湖羊鏈球菌病的病理組織學，本研究擬以患病湖羊為研究對象，采用菌的分離鑒定、石蠟切片和動物回感試驗等方法，以期探究感染羊的病理組織學和鏈球菌的致病性，為羊病防控提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病組織取自四川省某養殖場的病羊，在其瀕臨死亡時對其采取放血處死，并進行病理解剖。在無菌的條件下迅速采取肝、脾、肺等病變組織。

1.2 試驗試劑及儀器

無水乙醇購自成都海興化工試劑廠；二甲苯購自天津市致遠化學試劑有限公司；多聚甲醛購自成都市科龍化工試劑廠；蘇木素、醇溶伊紅購自Biosharp公司。1.1×T3 Super PCR Mix購自北京天根生化科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；擴增16S rDNA引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

Leica RM2235S手輪轉動式切片機、Leica BME光學顯微鏡購自德國徠卡微系統有限公司；凝膠成像系統購自美國BIO-RAD公司；WGZ-2XJ濁度計(細菌)購自上海昕瑞儀器儀表有限公司。

1.3 病羊臨床觀察

查看患病羊群的體溫、身體狀況、食欲和活動情況，記錄臨床癥狀。

1.4 病羊病理解剖觀察

病羊靜脈放血后立即處死，進行解剖和觀察病變。用接種環蘸取其肺、肝等病變組織內部，劃線于LB平板，保存于冰盒中。及時送回實驗室進行細菌的分離純化鑒定和菌種保存。取大小為5 mm×5 mm×2 mm的病變組織用生理鹽水沖洗1～2 次，再保存于4%(V多聚甲醛∶V磷酸緩沖液=1∶25)多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L pH 7.4)中。病變組織進行拍照和分析記錄。

1.5 病羊病理切片制作及觀察

將已在4%多聚甲醛中固定24 h以上的病變組織取出，用流水緩慢沖洗24 h。依次放入不同比例的乙醇中脫水、二甲苯中透明、石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ中浸蠟1 h。將浸蠟好的組織包埋于包埋框中，包埋石蠟的溫度應比浸蠟的溫度略高。最后切片、貼片、烤片、H.E.染色、封片，自然風干后于Leica光學顯微鏡下觀察病理特征。

1.6 細菌分離鑒定

將接種病變組織細菌的培養基放入37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。之后對平板里的菌按照常規操作進行分離和純化后，從接種肺組織菌的LB平板里分離出1株菌，命名為Z-1，挑取單菌落接種于LB液體培養基，180 r/min下37 ℃震蕩培養12 h，進行革蘭氏染色、生理生化鑒定及16S rDNA基因鑒定。革蘭氏染色鑒定按照《微生物學與免疫學實驗教程》，生化鑒定按照《伯杰細菌鑒定手冊》中細菌鑒定的方法，采用細菌生化微量鑒定管對菌株Z-1進行生化鑒定和結果判定?；蜩b定則是先對菌液進行細菌DNA提取、以16S rDNA通用引物(F2：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R2：CTACGG-CTACCTTGTTACGA)PCR擴增16S rDNA基因，并將擴增的PCR產物送去上海生工生物工程股份有限公司進行測序鑒定。反應體系為25 μL，DNA模板1 μL，引物各1 μL，1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，PCR條件為預變性98 ℃ 2 min、變性98 ℃ 10 s、退火55 ℃ 10 s、延伸72 ℃ 30 s、35個循環、72 ℃再延伸2 min。

1.7 動物回感試驗

將10只體重為20 g左右健康狀態良好的昆明小鼠，隨機分成試驗組和對照組。試驗組5 只，對照組5 只。將上述純化的Z-1菌于LB液體37 ℃培養12 h，用生理鹽水稀釋沉淀，制成細菌懸液。用細菌濁度計將菌液濃度調整至為5.876×108cfu/mL，試驗組每只小鼠腹腔注射0.2 mL菌懸液，對照組注射相同體積的生理鹽水，試驗周期為7 d。觀察并記錄小鼠的發病情況、身體狀況、活動和死亡現象，對死亡的小鼠及時采取病理解剖和病原鑒定。

1.8 藥敏試驗

采用K-B紙片法對菌株Z-1進行藥敏試驗，將菌株Z-1接種50 mL的LB液體培養基中，37 ℃震蕩培養12 h。用WGZ-2XJ濁度計和無菌水將菌液濃度調整成0.5麥氏單位，取100 μL涂布于MH瓊脂平板上，并將藥敏紙片貼于其上，35 ℃培養18 h。用直尺測量抑菌圈長度，結果依據美國臨床實驗室標準委員會(CLSI/NCCLS)標準判定。藥敏紙片有：氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、慶大霉素、鏈霉素、妥布霉素、阿米卡星、克林霉素、多西環素、氨卞西林、頭孢哌酮、青霉素、拉氧頭孢、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢噻肟、氨曲南、頭孢克肟、利福平、痢特靈、氟苯尼考和卡那霉素。

2 結果與分析

2.1 病羊的臨床癥狀

患病羊的發病特征為持續性咳嗽一周，并時常伴有喘氣聲，呼吸困難?？诒侵車鷷r常會有黃色濃稠分泌物，體溫上升到40 ℃。精神狀況差，食欲差，運動減少。

2.2 病羊的解剖變化

對患病羊靜脈放血處死后，觀察各臟器，結果發現：肺組織充血水腫、肺葉增大，呈暗紅色。將肺組織切成小塊，流出多量血樣泡沫狀液體，將小塊肺組織放于水中，可見其半漂浮于水面上(圖1(a))；肝體積增大，被膜緊張，顏色呈暗紫色，切面有暗紅色血液流出(圖1(b))；腎臟腫大，顏色暗紅，腎表面觀察到大面積的樹狀充血，充血區域和周圍組織分界明顯。在腎皮質區還可見到灰黃色或者灰白色的化膿性小灶(圖1(c))；腸管擴張，腸壁變薄，出血嚴重，表面可見紅色黏液，切開腸腔，腸腔內充盈大量黃色的黏液，內容物混有血液(圖1(d))。從這些癥狀初步推斷為肺炎并發多器官組織感染。

(a)肺腫大，可見暗紅色的肺小葉;(b)肝呈暗紫紅色病變;(c)腎間質出血，擴張，有明顯化膿小灶;(d)腸病變明顯，可見鼓氣，出血性黏液。
(a) The lungs are enlarged. Dark red lobules are seen. (b) The liver is dark purplish red. (c) Renal interstitial hemorrhage, dilatation, and small purulent lesions. (d) Intestinal lesions are obvious, with visible swelling and hemorrhagic mucus.
圖1 湖羊病理剖解變化
Fig.1 Pathological and anatomical changes of Hu sheep

2.3 病羊的病理組織學變化

取病羊肺、肝、腎、腸、脾等組織制作病理切片，經H.E.染色，封片保存。觀察可見，肺：細支氣管壁增厚、充血、水腫，管腔中有漿液滲出、炎性細胞浸潤和脫落的上皮細胞。肺泡壁毛細血管擴張、充血、出血，肺泡腔內充滿了粉紅色纖維素性滲出物和少量紅細胞。組織中有大量的淋巴細胞和嗜中性粒細胞浸潤(圖2(a)、2(b))。肝：肝竇擴張充血，出現大量的紅細胞，嗜中性粒細胞和灶性炎細胞浸潤，肝索變細，排列紊亂(圖2(c))。腎：腎小管上皮細胞腫脹、脫落，細胞核破碎、溶解。腎小球體積縮小，腎小囊腔增大。腎間質小血管和毛細血管擴張，充血、出血和少量淋巴細胞浸潤。腎小管腔中可見淡粉紅色的蛋白積液，即透明管型(圖2(d))。腸：小腸腺體上皮細胞變性、壞死、脫落，可見少量嗜中性粒細胞，血管擴張充血，淋巴細胞浸潤(圖2(e))。脾：脾髓質部排列疏松，出現大量紅細胞，淋巴細胞減少，含鐵血黃素沉積(圖2(f))。從病理組織學上進一步判斷為纖維素性肺炎并伴有多組織炎癥。

2.4 病羊肺組織的細菌鑒定

革蘭氏染色結果顯示，菌體呈球形，有的呈雙球排列或單個存在，菌體邊緣光滑，顏色為藍紫色，為革蘭氏陽性菌(圖3(a))。菌株Z-1的生化結果顯示：乳糖、麥芽糖、七葉苷、蔗糖、果糖、木糖、山梨醇、精氨酸水解均呈陽性反應；硝酸鹽還原、尿素、木糖醇、甘露糖、甘露醇、覃塘、蜜二糖均呈陰性反應。該菌株生化結果與《伯杰細菌鑒定手冊》中關于鏈球菌生化鑒定描述基本一致(表1)。分離菌的16S rDNA擴增結果顯示，有 1 428 bp 目的條帶出現(圖3(b))，將測序結果經NCBI比對顯示其與菌株NR_026471相似性最高，達到98%以上。革蘭氏染色、生化和16S rDNA鑒定一致，綜合判斷該菌株為鏈球菌。

2.5 動物回感試驗

腹腔注射菌液12 h后，試驗組部分小鼠活動開始減弱，精神萎靡，食欲減退，背毛倒立雜亂。48 h時試驗組開始出現第一只小鼠死亡，72 h后有2 只老鼠相繼死亡，剩下2 只小鼠也陸續在第4天至第6天內死亡，在試驗周期內正常組小鼠無異常。無菌條件下，解剖死亡小鼠發現肺、肝等均有明顯腫脹和充血，肝表面散在分布出血點，這些病變與患病湖羊剖解變化一致。用無菌接種環穿刺肺、肝組織內部，劃線于LB培養基，24 h培養后挑取單菌落于LB液體培養，經鑒定為鏈球菌，與病羊中分離出的菌種一致。

2.6 藥敏試驗

K-B藥敏紙片法結果顯示：菌株Z-1對氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、慶大霉素、鏈霉素、妥布霉素、阿米卡星、多西環素等敏感；對氨芐西林、青霉素、拉氧頭孢、頭孢唑林、頭孢噻肟、氨曲南等耐藥；對克林霉素、頭孢哌酮較敏感(表2)。

3 討論與結論

羊纖維素性肺炎可由傳染性因素或非傳染性因素引起，主要以細支氣管和肺泡內填充大量纖維性滲出物為特征，是一種引起持續性高溫的急性肺炎[10]，此型肺炎常侵犯一側肺或全肺，通常又稱之為大葉性肺炎。Besser等[11]報道大角羊肺炎會引起細支氣管中漿液滲出和上皮細胞脫落，這與該患病羊肺細支氣管中填充大量漿液，肺毛細血管擴張、充血，炎性物質滲出病理變化基本一致。但與Lindstrom等[12]對瑞典羔羊支氣管肺炎的病理變化和細菌學報道有所區別，該研究中除了充血、炎性物質滲出這些基本病理變化外，還伴隨有透明疤痕，支氣管上皮增生以及膿性灶的出現。這可能與其肺組織病變嚴重，并且由肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌、支原體等混合感染有關。

引起纖維素性肺炎的病原菌較多，常見的有支原體、鏈球菌、嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌等，多經呼吸道感染，然后迅速沿支氣管樹擴散。試驗中引起纖維素性肺炎的分離菌株Z-1經鑒定為鏈球菌，為無宿主專嗜性革蘭氏陽性菌，菌體呈雙球型呈鏈狀排列，也有單個存在，屬需氧或兼性厭氧菌[13]。受該菌感染的動物主要引起呼吸道疾病，繼而還可以引發敗血癥、腦膜炎、心內膜炎等多種疾病[14]，其中羔羊和母羊的感染率高于其他年齡階段的羊，并且綿羊易感于山羊。錢一相等[15]在山羊鏈球菌病診治和李輝[16]對羊鏈球菌病的病理組織學均與本病例中湖羊感染鏈球菌的情況相似，肺泡壁水腫、充血，肺上皮細胞脫落，肺泡中充滿紅細胞，有纖維素性滲出物，有中性白細胞的浸潤。剖解中觀察到腦組織輕微水腫，血管擴張充血，病理組織學觀察到血管中有大量紅細胞出現，這與陳申申等[17]在對致仔豬腦膜炎豬鏈球菌的分離鑒定報道中情況一致。與Eroksuz等[18]在鮑曼不動桿菌引起2歲母羊腦膿腫和支氣管肺炎的研究中有所差異， 在化膿性的腦炎，腦膿腫以及在腦切片中發現了微生物團塊。

(a)、(b)肺可見充血、水腫、粉紅色纖維素，大量炎癥細胞浸潤;(c)肝竇擴張充血，肝索排列紊亂;(d)腎小球萎縮，上皮細胞腫脹，脫落;(e)小腸腺細胞變性、壞死，血管擴張充血，淋巴細胞浸潤;(f)脾組織排列疏松，含鐵血黃素沉積。每一個圖中的小方框圖，為局部擴大圖。
(a) and (b): Hyperemia, edema and pink cellulose can be seen in the lungs, with numerous inflammatory cells infiltrating. (c) Dilatation and congestion of hepatic sinus, disordered arrangement of hepatic cords. (d) Glomerular atrophy, epithelial cell swelling, shedding. (e) Denaturation and necrosis of small intestinal adenocytes, vascular dilatation and congestion, lymphocyte infiltration. (f) Loose arrangement of spleen with hemosiderin deposition. The small square graph in each graph is local enlarged image.
圖2 湖羊病變組織的病理切片(H.E.染色400×)
Fig.2 Pathological section of diseased tissues of Hu Sheep (H.E. staining 400×)

(a) 革蘭氏染色結果; M: DL-2000 DNA marker; 1: Z-1菌株; (b) 16S rDNA鑒定結果
(a) Gram staining results; M: DL-2000 DNA marker; 1: Z - 1 strain; (b) 16S rDNA identification results
圖3 Z-1菌株鑒定結果
Fig.3 Identification results of z-1 strain

表1 菌株Z-1的生化試驗結果
Table 1 Biochemical results of strain Z-1

項目Item結果Result項目Item結果Result硝酸鹽還原 Nitrate reduction-木糖 Xylose+乳糖 Lactose+甘露糖 Mannose-尿素 UREA-山梨醇 Sorbitol+麥芽糖 Malt sugar+甘露醇 Mannital-七葉苷 Aesculin+精氨酸水解 Arginine hydrolysis+蔗糖 Sucrose+覃糖 Tain sugar-木糖醇 Newtol-蜜二糖 Melibiose-果糖 Fructose+

注：+ 為陽性； -為陰性。

Note：+, positive； -,negative.

表2 菌株Z-1藥敏試驗結果Table 2 Drug sensitivity test results of strain Z-1

表2(續)

綜上所述，本研究依據臨床癥狀、現場解剖觀察、切片分析以及對患病羊細菌分離純化鑒定，分析該病羊可能是由于冬春季節天氣寒冷，造成抵抗力下降，感染鏈球菌誘發的纖維素性肺炎，進而導致急性發病、死亡。羊鏈球菌病是一種急性，熱性傳染病。在日常的養殖中，特別是集約化養殖時，要注意羊場通風，飼養管理科學化、合理化，加強衛生管理，糞便經常清理，養殖密度不應過大。本病例鑒定的詳細報告為羊鏈球菌病的診斷與防控提供參考價值。