枸杞多糖對乙醇誘導肝細胞損傷的保護作用研究

李永盛，王茂鶴，劉建飛，邸多隆，劉曄瑋，魏鑒騰*

1蘭州大學公共衛生學院 營養與食品衛生學研究所；2中國科學院蘭州化學物理研究所中科院西北特色植物資源化學重點實驗室；3甘肅中醫藥大學藥學院，蘭州 730000

寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)多年生落葉灌木，其果實(枸杞子)作為常用的藥食同源品種被列入“藥食同源物品目錄”[1,2]。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBPs)是從枸杞子中提取分離得到的一類活性多糖，現代醫學研究表明：LBPs具有抗氧化、預防和修復肝細胞損傷、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗炎等多種藥理和生理活性，在預防和治療各種慢性疾病方面發揮著重要的作用[3]。同時，LBPs已被證明在多種肝損傷模型中具有保護作用，如CCl4誘導的化學性肝損傷[4]、藥物性肝損傷[5]、酒精性肝損傷[6]以及非酒精性脂肪肝[7]。

近年來的研究表明，LBPs是一組水溶性糖復合物，其種類繁多，結構復雜，含量約占干果總重量的5%～8%，其分子量范圍為2～241 kDa[8]。影響LBPs活性的因素很多，其中分子量是重要因素之一。如Zhang等[9]利用膜分離技術分離得到的平均分子量為10.2 kDa的LBPs-a4表現出抑制SMMC-7721細胞增殖的活性，但平均分子量為6.50×103kDa的LBPs-p8的作用相反，其認為分子量是影響LBPs凋亡誘導活性的關鍵因素。Tang等[10]利用膜分離技術分離得到兩種不同分子量范圍LBPs，其中平均分子量為4.92 kDa的LBPs具有降糖活性。目前，LBPs保護乙醇誘導肝損傷活性的最佳分子量范圍沒有明確報道，因此，我們通過體外培養人正常肝細胞(L-02細胞)建立乙醇誘導肝細胞損傷模型，研究不同分子量范圍LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷的保護作用，得出LBPs最佳分子量范圍，研究結果可為LBPs保肝功能食品及藥物的應用開發提供實驗基礎和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗中所用樣品為2017年采自我國寧夏中寧產區的寧杞Ⅰ號枸杞，經鑒定為寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實。LBPs由中科院西北特色植物資源化學重點實驗室制備，采用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量[11]。稱取枸杞粉末200.00 g，以料液比1∶12(g/g)在60 ℃下高速剪切1 h(8 000 rpm)，抽濾后70%醇沉，經冷凍干燥得粗多糖(LBPs0)，其含量(得率)為65.19%(8.92%)。LBPs0經水溶解、膜過濾、冷凍干燥得分子量截留值(MWCO)分別為30、10、5、2 kDa的不同分子量范圍LBPs(LBPs1、LBPs2、LBPs3、LBPs4)，其含量(得率)依次為74.90%(28.65%)、56.18%(21.55%)、62.42%(25.22%)、59.30%(16.75%)。

1.2 試劑與儀器

Hyclone RPMI 1640培養基(美國Thermo Fisher公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；無水乙醇(分析純，天津市大茂化學試劑廠)；二甲基亞砜、噻唑藍(MTT)、乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測試劑盒和活性氧(ROS)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；谷丙轉氨酶(ALT)測試盒和谷草轉氨酶(AST)測試盒(南京建成生物工程研究所)。

CCL-170T-8型ESCO CelCulture 二氧化碳恒溫培養箱(新加坡ESCO公司)；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；XD-30A型倒置生物顯微鏡(舜宇光學科技(集團)有限公司)；XL-12K型微量離心機(湖南湘立科學儀器有限公司)；DNM-9602G型酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)；TU-1901雙光束紫外可見光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；FLUOROMAX-4P瞬態熒光光譜儀(日本HORIBA集團)；FV1200型激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus集團)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

將人正常肝細胞(L-02細胞)培養于含10%FBS、1%青-鏈霉素混合溶液的RPMI-1640培養基中，在含有5% CO2的37 ℃恒溫加濕培養箱中培養。

1.3.2 乙醇誘導肝細胞損傷模型的構建和LBPs對肝細胞活力的影響

用MTT法篩選乙醇損傷濃度以構建乙醇誘導肝細胞損傷模型，并考察不同分子量范圍LBPs對肝細胞活力的影響，乙醇和LBPs處理時間分別設定為4和24 h[12]。取對數生長期的L-02細胞，接種于96孔板中(5×103個細胞/200 μL/孔)，37 ℃孵育24 h。吸棄原有培養基，分別加入含不同濃度乙醇(0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%(V/V))的培養基培養4 h、分別加入含不同濃度不同分子量范圍LBPs(12.5、25、50、100、200 μg/mL)的培養基培養24h，每組設6個復孔。加入MTT溶液(5 mg/mL，20 μL/孔)，繼續培養3.5 h。吸棄原培養基，加入二甲基亞砜(DMSO，150 μL/孔)，震蕩10 min，待結晶物完全融解后，用酶標儀在495 nm處測定各孔吸光度(absorbance，A)，細胞活力計算公式：

1.3.3 LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷細胞活力的影響

取對數生長期的L-02細胞，接種于96孔板中(5×103個細胞/200 μL/孔)，37 ℃孵育24 h。實驗設立正常對照組，乙醇損傷組，LBPs保護組，每組設6個復孔。吸棄原培養基，正常對照組加入新鮮培養基，乙醇損傷組和LBPs保護組加入含適當濃度乙醇的培養基，培養4 h。吸棄培養基，對照組和乙醇損傷組加入新鮮培養基，LBPs保護組加入含不同濃度不同分子量范圍LBPs的培養基，培養24 h。用MTT法測定細胞活力。

1.3.4 LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷細胞培養液中ALT、AST和LDH釋放的影響

為評價LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷細胞中酶釋放的影響程度，測定不同分子量范圍LBPs干預后培養細胞上清液中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(ALT)和乳酸脫氫酶(LDH)的酶活力[6]。取對數生長期的L-02細胞接種于12孔板中(2.4×105個細胞/2 mL/孔)，每組設3個復孔，分組及干預方法同“1.3.3”，取培養細胞上清液待測。嚴格按ALT、AST和LDH測定試劑盒說明書操作，根據標準曲線計算各組轉氨酶活力。

1.3.5 LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷細胞內活性氧水平的影響

定性和定量檢測LBPs干預后細胞內活性氧(ROS)水平的變化，觀察不同分子量范圍LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷細胞內ROS水平的影響[12]。取對數生長期的L-02細胞接種于預先放置有φ20 mm細胞爬片的12孔板中，每組設3個復孔，分組及干預條件同“1.3.3”。裝載熒光探針：吸棄培養基后，各組加入1 mL含10 μmol/L DCFH-DA 探針的無血清培養基，孵育20 min后，用PBS洗滌細胞三次。在激發波長488 nm和發射波長525 nm條件下，用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡定性觀察各組細胞內熒光水平，用熒光光譜儀定量檢測細胞內熒光強度，即ROS水平。

1.3.6 數據分析

利用IBM SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析，使用Dunnett檢驗和Tukey檢驗進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 乙醇誘導肝細胞損傷模型的構建和LBPs對肝細胞活力的影響

如圖1(A)所示，細胞活力隨乙醇濃度升高而逐漸降低，具有劑量依賴性。當乙醇損傷濃度為5%時，細胞活力為79.46%±2.95%，顯著低于濃度為0%時的細胞活力(P<0.01)，選擇5%乙醇損傷細胞4 h構建乙醇誘導肝損傷模型。如圖1(B)所示，LBPs濃度在(0～200)μg/mL間的細胞活力無顯著性差異(P>0.05)，可知不同分子量范圍LBPs均對細胞增殖沒有抑制和促進作用。

圖1 乙醇和LBPs對肝細胞活力的影響

2.2 LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷細胞活力的影響

如圖2所示，與對照組相比，乙醇損傷組細胞活力顯著降低(P<0.01)，細胞活力為72.02%±3.80%。與乙醇損傷組相比，當LBPs濃度在25～100 μg/mL時，LBPs0、LBPs2、LBPs3、LBPs4保護組的細胞活力均顯著高于乙醇損傷組(P<0.05)，在LBPs0 12.5～100 μg/mL、LBPs2 12.5～50 μg/mL、LBPs3 12.5～100 μg/mL、LBPs4 12.5～200 μg/mL時的細胞活力隨濃度增加而升高；LBPs1濃度在12.5～200 μg/mL間的細胞活力均與乙醇損傷組相比無統計學差異(P>0.05)，且均低于其他分子量范圍LBPs。除LBPs1外，不同分子量范圍LBPs均在較低濃度(25 μg/mL)時即產生保護作用，故選取25 μg/mL LBPs作用24 h進行后續酶活力和細胞內ROS水平測定。此外，由兩兩比較結果可知，LBPs3保護組在不同濃度下的細胞活力均高于其他LBPs保護組。以上結果提示不同分子量范圍LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷細胞活力的保護作用不同，LBPs3的保護作用最強。

圖2 LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷細胞活力的影響

2.3 LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷細胞培養液中ALT、AST和LDH釋放的影響

細胞培養液中ALT、AST和LDH酶活力水平測定結果見圖3(A、B、C)，乙醇損傷組細胞培養液中ALT、AST和LDH酶活力水平顯著高于正常對照組(P<0.01)，分別為正常對照組的3.10、3.25和1.86倍。經25 μg/mL LBPs處理后，細胞培養液中ALT、AST和LDH酶活力水平均顯著低于乙醇損傷組(P<0.05)，其中LBPs3保護組酶活力最低，分別為乙醇損傷組的0.50、0.42和0.67倍。結果表明，乙醇可使細胞膜受損而使胞內大量的酶釋放入細胞培養液，不同分子量范圍LBPs均可修復由乙醇引起胞內酶的釋放，LBPs3的修復作用最強。

圖3 LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷細胞培養液中ALT(A)、AST(B)和LDH(C)釋放的影響

圖4 LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷細胞內ROS水平的影響

2.4 LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷細胞內ROS水平的影響

由圖4(A-I)可見，乙醇損傷組熒光強度較正常對照組明顯升高，而LBPs1、LBPs2、LBPs3、LBPs4組明顯低于乙醇損傷組。由圖4(A-III)和圖4(B)可知，與正常對照組相比，乙醇損傷組的熒光強度顯著升高(P<0.01)，與乙醇損傷組相比，LBPs1、LBPs2、LBPs3和LBPs4保護組的熒光強度值顯著降低(P<0.05)，分別較乙醇損傷組降低了17.11%、24.64%、34.87%、17.59%。結果表明，不同分子量范圍LBPs均對乙醇誘導的細胞內ROS水平升高有顯著的抑制作用，LBPs3的抑制作用最強。

3 討論與結論

本研究利用MTT法對不同濃度不同分子量范圍LBPs的乙醇誘導肝損傷保護活性進行初步篩選，結果發現LBPs0、LBPs2、LBPs3、LBPs4對乙醇誘導肝細胞損傷的細胞活力隨濃度增加而增高，且在較低濃度25 μg/mL時即具有保護作用，與Zhang[12]的研究一致，故使用25 μg/mL LBPs作為干預條件進行后續研究。

諸多研究[13,14]證實乙醇誘導的肝損傷依賴于ROS的生成，線粒體產生過量的ROS介導了氧化應激、細胞功能喪失并最終導致細胞凋亡或壞死。過量的ROS能促使細胞發生脂質過氧化使細胞器膜或細胞膜受損，從而使胞內酶類(如轉氨酶等)釋放到細胞外[15]，肝轉氨酶的釋放水平與肝細胞損傷程度有密切聯系，其釋放是肝細胞受損的主要敏感指標[16]；過量的ROS還可損傷線粒體本身，從而介導線粒體凋亡途徑，細胞內LDH則響應凋亡信號從細胞中釋放出來，LDH的釋放是細胞凋亡的主要指標[17]。LBPs是枸杞子主要的活性成分之一，大量研究發現LBPs具有抗氧化活性[3,18]。本研究表明，LBPs主要通過以下三方面作用發揮保護作用：扭轉乙醇誘導的肝細胞活力降低；防止乙醇對肝細胞膜的損傷作用而使ALT、AST、LDH的釋放降低；抑制乙醇所致肝細胞內ROS的產生。本研究發現LBPs可顯著降低乙醇誘導的肝細胞ROS水平，推測LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷的保護作用是通過抑制氧化應激而發揮的，與Xiao等[7]和Varoni等[5]的研究一致，后期應結合LBPs的單糖組成、糖苷鍵和功能基團等結構特征深入探討其抗氧化應激的分子機制。

近年的研究發現，多糖的生物活性與單糖組成、連接方式、分子量和構象等結構特征有關，分子量對生物活性的影響顯著且復雜[19,20]。研究顯示，不同來源多糖其最佳活性的分子量范圍不同：Deng等[11]利用膜分離技術分離得到5種LBPs，經動物實驗發現5種LBPs均對H22荷瘤小鼠腫瘤生長有抑制作用，且分子量范圍為40～350 kDa的LBPs3具有最佳活性；分子量范圍為15.2～40.1 kDa的黃芪多糖具有顯著的免疫活性[21]，平均分子量為6.53 kDa的紫球藻多糖的免疫調節活性和及抗腫瘤活性最強[22]，平均分子量為306.2 kDa的香菇多糖具有最強的體內抗氧化活性[23]，平均分子量為5.5 kDa的紅景天多糖的抗氧化活性及保肝活性比425.7 kDa的紅景天多糖更強[24]。本研究發現不同分子量范圍LBPs有不同程度的肝保護活性：分子量范圍為5～10 kDa的LBPs3的肝保護活性最強，其多糖含量和得率高(僅次于LBPs1，均高于LBPs4和LBPs2)；分子量范圍分別為2～5 kDa和10～30 kDa的LBPs4和LBPs2的肝保護活性次之(二者的多糖含量和得率低)；分子量范圍為>30 kDa的LBPs1肝保護活性最弱。高分子量范圍LBPs活性低，可能是由于其具有較高的表觀粘度和較差的水溶性，難以通過生物膜屏障和進入生物體細胞內發揮其功能，但其分子量范圍過低，則難以形成有活性的聚合物構象[23]，本研究提示分子量范圍適中的LBPs3具有較高的開發利用價值，結果與Minjares和You等[23,25]的報道一致。

本研究表明：LBPs在0～200μg/mL間對肝細胞增殖無抑制或促進作用，其可通過提高細胞活力，降低ALT、AST、LDH的釋放和抑制細胞內ROS的產生而發揮對乙醇誘導肝細胞損傷的保護作用。不同分子量范圍LBPs對乙醇誘導肝細胞損傷的保護活性不同，分子量范圍為5～10 kDa的LBPs3最強，其次為2～5 kDa的LBPs4和10～30 kDa的LBPs2，>30 kDa的LBPs1最弱。本實驗結果可為LBPs保護肝細胞損傷功能食品及藥物的應用開發提供實驗基礎和理論指導。