山楂葉標準湯劑指紋圖譜及抗氧化活性譜效關系研究

王子怡，穆文成，李艷榮，洪 霞，潘海峰

承德醫學院河北省中藥研究與開發重點實驗室，承德 067000

山楂葉是薔薇科植物山里紅CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br或山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥葉，具有活血化瘀，化濁降脂的功效[1]。山楂葉標準湯劑是參考現代提取方法，經標準化工藝制備成的單味山楂葉飲片水煎劑[2]。研究表明，山楂葉的主要生理活性成分為黃酮類[3-7]，黃酮類化合物可能是除維生素C之外的另一類天然抗氧化劑[8,9]。由于山楂葉標準湯劑主要為極性成分，其抗氧化活性較強，清除自由基的能力是評價其抗氧化能力的一個重要指標[10]。關于抗氧化的化學分析方法主要包括ABTS自由基清除法和DPPH自由基清除法，通過化學法能夠確定天然產物清除自由基或對抑制脂類物質氧化的能力，從而評價天然產物的抗氧化活性。運用ABTS自由基清除法是因為該方法操作簡單，不需要復雜的反應步驟及難以實現的反應條件，并且去除了測試物質中含有的過氧化物對ABTS自由基清除自由基的影響，能夠準確確定多組分混合物的抗氧化能力，因此它更多地用于評價天然產物的抗氧化活性[11,12]。DPPH自由基清除實驗是一種簡單、有效且經濟的方法，測出的結果重復性較好，受環境因素的影響較小[13]，同其它抗氧化活性的測定方法相比，該方法具有較高的靈敏度，沒有伴隨復雜反應，并能夠與色譜分離法相結合，常用于在線檢測天然產物的抗氧化活性[14]。

由于中藥標準湯劑大多具有作用機制復雜，作用靶點多樣等特點，需要對其進行整體質量控制，通過共有峰標定和相似度評價等手段能夠較全面體現中藥整體性的指紋圖譜是符合標準湯劑特點的方法之一[15]。另一方面，中藥藥效的發揮有賴于多個成分的協同作用，指紋圖譜雖能標示中藥中的多種成分，但這些化學成分的標示與中藥藥效的發揮可能不完全一致，因此僅僅研究中藥的化學指紋圖譜還遠遠不夠，只有將中藥的化學指紋圖譜與中藥的藥效緊密結合起來，建立具有實際意義的譜-效關系，才能為中藥質量控制提供更科學的依據[16]。

目前關于山楂葉標準湯劑及其抗氧化活性譜效關系的研究未見報道，本文通過DPPH自由基和ABTS自由基清除法評估山楂葉標準湯劑黃酮類成分抗氧化活性，分析標準湯劑抗氧化作用，并采用灰關聯度法研究其HPLC指紋圖譜與抗氧化活性的譜效關系，為山楂葉標準湯劑的質量標準制定提供有效依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，JA2003上皿天平(上海精科天平)，電熱套(通州市申通電熱器廠)，AG-245型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利公司)，HC-2062高速離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司)，酶標儀(Thermo Fisher Scientific)，KQ-2200DE超聲波清洗器(哈爾濱東明醫療儀器廠)。

1.2 試劑

甲醇、乙腈(色譜純，Fisher科技有限公司)，其他試劑均為分析純，水(杭州娃哈哈有限公司)，DPPH自由基(464RB-GE，上?；晒I發展有限公司)，ABTS自由基(M0403A，澤浩公司)，維生素C(J1024A，澤浩公司)。

1.3 對照品

綠原酸(161217，成都普菲得生物技術有限公司)，牡荊素葡萄糖苷(171403，成都普菲得生物技術有限公司)，蘆丁(120226，上海融禾醫藥科技有限公司)，金絲桃苷(161231，上海融禾醫藥科技有限公司)，牡荊素鼠李糖苷(111668-2000602，中國藥品生物制品檢定所)。

1.4 材料

16批山楂葉藥材由承德民族師范學院董建新教授鑒定為薔薇科植物山楂葉。樣品標本存放在承德醫學院中藥研究所。樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 色譜條件

采用Agilent Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，0.2%甲酸水-乙腈(A-B)梯度洗脫；流速設定為0.8 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長為320 nm；柱溫為30 ℃，洗脫梯度見表2。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標準湯劑的制備[2]

精密稱定山楂葉粗粉100 g，置于圓底燒瓶中，加入蒸餾水1 200 mL浸泡30 min，用電熱套以1 d/s的滴速加熱回流，第1次30 min，回流完畢趁熱用3層紗布過濾，殘渣加1 000 mL蒸餾水第2次回流20 min，回流完畢趁熱用3層紗布過濾，合并2次濾液，采用冷凝水循環裝置水浴蒸發45 ℃減壓濃縮至500 mL，即得棕色或綠色濃度為0.2 g/mL的山楂葉標準湯劑。

表2 洗脫梯度

2.2.2 供試品溶液的制備

取山楂葉標準湯劑1 mL與16%乙腈1 mL混勻，以12 000 rpm超速離心10 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液作供試品溶液。

2.2.3 陽性對照維生素C溶液的制備

精密稱取維生素C，以蒸餾水溶解，配制成1.928 mg/mL的Vc溶液。

2.2.4 DPPH自由基溶液的制備

精密稱取DPPH自由基12.00 mg，放置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度線，即得0.12 mg/mL的DPPH自由基溶液，避光備用。

2.2.5 ABTS自由基溶液的制備

精密稱取ABTS自由基38.40 mg，用蒸餾水定容至10 mL容量瓶，即得3.84 mg/mL的ABTS自由基初始溶液。精密稱取過硫酸鉀13.40 mg，放置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線即得過硫酸鉀溶液。ABTS自由基初始溶液和過硫酸鉀溶液各取2.5 mL，放置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線即得ABTS自由基溶液，避光放置12～16 h備用。

2.2.6 數據處理

IC50值計算時，由于各提取液對自由基的清除率與濃度不呈線性關系，因此使用SPSS19.0中Probit方法進行回歸分析，擬合得相應的方程Probit(p)=Intercept+Bx，再通過卡方檢驗后得到IC50值(Probit=0.50時提取液的生藥濃度)，IC50值越小表示提取液的抗氧化能力越強。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 方法學考察

2.3.1.1 穩定性試驗

取山楂葉標準湯劑的供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，在不同的時間點(0、4、6、8、10、24 h)分別進樣，計算18個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，得出RSD分別為小于1.5%和小于2.0%。表明山楂葉標準湯劑在24 h內穩定。

2.3.1.2 精密度試驗

取“2.2.1”項制得的標準湯劑，按上述方法連續進樣6次樣品，以牡荊素葡萄糖苷的峰面積和保留時間為參照計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD分別小于0.8%和小于1.0%。表明儀器精密度良好。

2.3.1.3 重復性試驗

取同一標準湯劑6份，按“2.2.2”項下方法分別制備供試品溶液進行測定，計算18個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別低于0.8%和低于1.0%。表明該方法重復性良好。

2.3.2 樣品指紋圖譜的確定

將16批山楂葉標準湯劑HPLC色譜圖輸入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統 2004A版》進行數據處理，設S1為參照圖譜，時間窗寬度0.40。以中位數法生成對照圖譜，可得山楂葉標準湯劑HPLC指紋圖譜色譜疊加圖。

2.4 不同產地山楂葉標準湯劑抗氧化活性

2.4.1 不同產地山楂葉標準湯劑對DPPH自由基的清除能力

參考文獻[19]的方法，并進行改進。將16批山楂葉標準湯劑稀釋成系列濃度的溶液，以Vc溶液作為陽性對照。測定測試液對DPPH自由基清除率的方法同“2.2.4”，測完清除率后按照“2.2.6”中的方法計算IC50值。

2.4.2 不同產地山楂葉標準湯劑對ABTS自由基的清除能力

參考“2.4.1”的方法，測定測試液對ABTS自由基清除率的及IC50值。

2.5 灰關聯度分析

對16批不同產地山楂葉標準湯劑HPLC指紋圖譜共有峰峰面積與DPPH自由基IC50值、ABTS自由基IC50值進行灰關聯度分析[17]，研究其相關性。將不同批次的山楂葉標準湯劑清除DPPH自由基活性IC50、山楂葉標準湯劑清除ABTS自由基活性IC50設為母序列，18個共有峰設為子序列共有峰分別用X1～X18表示。參考文獻[18,19]方法和步驟，首先求絕對差序列，最后求關聯系數并計算關聯度，其中分辨系數選取0.5。

2.5.1 排關聯順序

將18個子序列對同一母序列的關聯度按大小順序排列起來,便組成關聯序，記為x，它直接反映各個子序列對母序列的“貢獻”的大小。據此可尋找指紋圖譜共有峰對應的化學成分與抗氧化活性間的聯系。

2.5.2 譜效相關性分析

對山楂葉標準湯劑HPLC指紋圖譜中各共有峰峰面積數據與抗氧化活性進行灰色關聯度及關聯序分析。依據相對關聯度的大小，確定了各成分對抗氧化作用貢獻的大小順序。

3 實驗結果

3.1 山楂葉標準湯劑指紋圖譜結果

16批山楂葉標準湯劑指紋圖譜相似度除S1、S3批次外均大于0.94，共標記18個共有峰，見圖3。通過對照品及保留時間對對照圖譜中的色譜峰進行指認，指認出5個共有峰為綠原酸(6號峰)、牡荊素葡萄糖苷(11號峰)、牡荊素鼠李糖苷(12號峰)、蘆丁(13號峰)及金絲桃苷(14號峰)，見圖1和圖2。

圖1 混合對照品溶液的HPLC圖譜

圖2 山楂葉標準湯劑指紋圖譜共有模式

圖3 山楂葉標準湯劑HPLC指紋圖譜色譜疊加圖

3.2 不同產地山楂葉標準湯劑對DPPH自由基的清除能力結果

16批山楂葉標準湯劑對DPPH自由基的清除能力結果結果見表3和圖4。

表3 16批山楂葉藥材標準湯劑對DPPH自由基的清除率和半抑制率

續表3(Continued Tab.3)

編號No.生藥濃度Crudedrugconcentration(mg/mL)清除率Clearance(%)IC50(mg/mL)編號No.生藥濃度Crudedrugconcentration(mg/mL)清除率Clearance(%)IC50(mg/mL)258.230.6762.913.1364.150.7870.796.2568.841.5676.35S60.2511.080.84S150.2022.131.050.3921.920.3930.180.5029.210.7833.930.6741.061.0048.480.7851.691.2553.721.2571.141.5673.42S70.3922.392.34S160.2032.250.360.7833.910.2538.001.5645.610.3957.062.0051.660.5066.223.1370.130.6776.656.2573.100.7878.15S80.3919.003.101.0028.741.2533.191.5637.773.1356.536.2574.82

圖4 16批山楂葉藥材標準湯劑對DPPH自由基清除能力的比較

3.3 不同產地山楂葉標準湯劑對ABTS自由基的清除能力結果

16批山楂葉標準湯劑對ABTS自由基的清除能力結果見表4和圖5。

表4 16批山楂葉藥材標準湯劑對ABTS自由基的清除率和半抑制率

續表5(Continued Tab.5)

編號No.生藥濃度Crudedrugconcentration(mg/mL)清除率Clearance(%)IC50(mg/mL)編號No.生藥濃度Crudedrugconcentration(mg/mL)清除率Clearance(%)IC50(mg/mL)0.2525.050.3938.750.3938.390.5045.210.5045.680.6751.230.6748.280.7867.570.7874.571.5687.18S70.2011.781.05S160.1725.790.250.3922.750.2042.450.5026.450.2554.850.7845.010.3976.161.2553.430.5084.531.5674.120.7889.3S80.3918.961.670.5025.650.7836.331.2548.641.5662.286.2591.96

圖5 16批山楂葉藥材標準湯劑對ABTS自由基清除能力的比較

3.4 灰關聯度結果

DPPH自由基：X11>X17>X12>X13>X10>X4>X18>X16>X7>X9>X3>X5>X2>X15>X1>X14>X6>X8。根“2.3”指認的對照品，確立牡荊素葡萄糖苷>牡荊素鼠李糖苷>蘆丁>金絲桃苷>綠原酸，關聯度數據見表5。

ABTS自由基：X4>X17>X11>X13>X12>X10>X18>X7>X9>X3>X5>X6>X2>X15>X16>X1>X14>X8。根據“2.3”指認的對照品，確立牡荊素葡萄糖苷>蘆丁>牡荊素鼠李糖苷>金絲桃苷>綠原酸，關聯度數據見表6。

表5 山楂葉標準湯劑指紋圖譜與DPPH自由基抗氧化活性關聯度

表6 山楂葉標準湯劑指紋圖譜與ABTS自由基抗氧化活性關聯度

4 討論

4.1 色譜條件的優化

本試驗進行了色譜柱、流動相檢測波長等條件的優化。其中考察了色譜柱Agilent ZORBOX-SB C18及Agilent Extend C18；考察了0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，0.2%甲酸水(A)-乙腈(B)和0.2%甲酸水(A)-乙腈(B)-四氫呋喃(C)；并考察了280及320 nm檢測波長，最終確定了色譜柱Agilent Extend C18、320 nm波長、0.2%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脫，樣品分離效果較好，樣品峰較多且基線較平穩。

4.2 山楂葉標準湯劑指紋圖譜結果分析

由表7相似度結果可得除S1和S3批次外各批次山楂葉標準湯劑相似度均大于0.94。結合課題組前期對16批次山楂葉標準湯劑指紋圖譜主成分及聚類分析結果，可將16批樣品分成兩類：S1和S3批次為一類，其他批次為另一類。

表7 相似度分析結果

4.3 山楂葉標準湯劑對DPPH、ABTS自由基抗氧化活性分析

以Vc作為陽性對照，通過圖3，4顯然可見，河北保定(S2)、遼寧(S6)、安徽亳州(S11)、河南禹州(S14)、山東臨沂(S15)和山西運城降縣(S16)的IC50值較小，即這些產地的山楂葉藥材標準湯劑抗氧化活性較高，而山東泰安(S1)、河北博野(S3)的IC50值為3.21和1.94，其IC50值為最高，此產地山楂葉藥材的標準湯劑對DPPH和ABTS自由基的清除能力最弱，抗氧化活性也就最低。16批不同產地山楂葉標準湯劑指紋圖譜分析結果與其抗氧化活性一致，即S2、S4～S16批次相似度較高且抗氧化活性高，后續可對S2、S4～S16批次山楂葉標準湯劑進行進一步討論。S1和S3批次在HPLC色譜圖表現為同其他批次相比峰多且高；在供試品顏色方面表現為綠色；在化學成分方面可能與其抗氧化活性相關。山楂葉作為一種常用藥材，分布范圍極為廣闊，北到內蒙古，南至廣西，產地的不同，其光照、海拔、溫度、濕度、土壤等生態因素也會存在較大的不同，可能會導致其有效成分的藥效和含量存在一定的差異。山楂葉標準湯劑抗氧化活性較強可能與其黃酮結構有關，黃酮類化合物的抗氧化作用主要通過直接捕捉和清除氧自由基來實現,另外其抗氧化活性也與調節和提高體內抗氧化酶活性相關。本文對16批不同產地的山楂葉藥材標準湯劑的體外抗氧化作用進行了初步研究，可山楂葉藥材的質量分析評價、譜效關系研究等提供參考依據。

4.4 灰關聯分析結果

本文考察了山楂葉標準湯劑指紋圖譜與其抗氧化活性的相關譜效關系，山楂葉標準湯劑HPLC指紋圖譜中相似度數據與DPPH自由基、ABTS自由基抗氧化活性結果大致相似，16批山楂葉標準湯劑指紋圖譜共有峰對DPPH自由基與ABTS自由基的IC50值的相對關聯度均大于0.720。

前期考察了偏最小二乘法、多元線性回歸分析等數據分析方法，結果均不理想。而灰關聯度分析作為常用的譜效關系研究方法，是一種適用于系統信息較少的多因素分析方法，能夠較大程度上體現各成分間的相互作用。通過對山楂葉標準湯劑指紋圖譜共有峰峰面積及IC50值相關度進行排序，所需樣本量及計算量較小，且分析結果準確度高。灰關聯度分析結果可以說明山楂葉標準湯劑抗氧化活性是多組分共同起作用。其中牡荊素葡萄糖苷作用最強，可能與其羥基連接位置相關。

本文將山楂葉標準湯劑化學分析及體外活性結合，從譜效關聯性角度，為山楂葉標準湯劑的質量控制提供科學依據。