基于網絡藥理學分析半夏-黃芩-黃連治療幽門螺桿菌相關性胃炎的作用機制

張 彧，吳東升，徐 寅，楊仁義，喻 斌*

1湖南中醫藥大學，長沙4102082；2湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙410007

全球慢性胃炎最常見的原因是幽門螺桿菌(Helicobactorpylori,Hp)感染。Hp感染對胃黏膜造成進行性損傷，在消化性潰瘍、胃癌、胃MALT淋巴瘤等多種重要疾病中起著致病作用[1-3]。《幽門螺桿菌胃炎京都全球共識報告》認為Hp誘導的胃炎是消化性潰瘍及其并發癥以及胃癌最重要的危險因素，提出將Hp相關性胃炎作為一種獨立的疾病[4]。《第五次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告》指出，Hp相關性胃炎不管有無癥狀和(或)并發癥，都應該接受根除治療，根除Hp可顯著改善胃黏膜炎性反應，阻止或延緩胃黏膜萎縮，腸化生的發生和發展，部分逆轉萎縮[5]。目前我國Hp感染率達約50%[6]，傳統三聯/四聯根除Hp的方法受到感染人群基數大、Hp耐藥、再感染率高等嚴峻挑戰。

隨著中醫藥在現代醫學研究中的不斷深入，中藥同樣能發揮根除Hp的作用[7]。作者前期工作對中醫藥治療幽門螺桿菌感染的178篇文獻進行用藥規律分析發現，基于關聯規則計算藥物組合時“半夏-黃連-黃芩”置信度最高，且單味中藥使用頻次均在前5[8]，推測半夏-黃芩-黃連可能具有較好的幽門螺桿菌作用。網絡藥理學是一種藥物研究新模式，其系統性、整體性的研究特點與中醫整體觀、辨證論治原則相符，通過構建“分子-靶點-通路”多層次網絡，揭示中藥藥效物質基礎及其分子機制。故本文擬利用網絡藥理學方法更為系統和整體地研究“半夏-黃連-黃芩”治療Hp相關性胃炎的藥理機制，以期為進一步實驗研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 “半夏-黃芩-黃連”藥對的潛在活性化合物篩選

通過中藥系統藥理學技術平臺(TCMSP：http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.pHp)收集半夏、黃芩、黃連3味藥的化學成分。根據成分的藥物動力學(absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME)參數進行篩選，參考中藥系統藥理學技術平臺研發人員意見[9]，篩選條件為藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，化合物類藥性(drug likeness，DL)≥0.18，血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)≥-0.3，藥物半衰期(drug half-life，HL)≥4 h，得到符合條件的潛在活性化合物。

1.2 化合物、疾病潛在作用靶點預測及共同靶點篩選

針對篩選出潛在活性化合物，通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得這些潛在活性化合物的2D化學結構。將潛在活性化合物的SDF格式文件導入到Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)，限定研究物種為人類，由此獲得與潛在活性化合物最相關的靶點信息。

利用Gene Cards數據庫(http://www.genecards.org/)和OMIM數據庫(http://www.omim.org/)搜索關鍵詞幽門螺桿菌相關性胃炎(Helicobacterpylori-associated gastritis)，將兩數據庫檢索結果進行合并，刪除重復靶點，取交集，得到HAG的潛在致病靶點。

將潛在活性化合物的作用靶點和HAG的致病靶點導入bioinformatics Evolutionary Genomics數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，將潛在活性化合物和HAG共同靶點相映射，取交集最終獲得“半夏-黃芩-黃連”治療HAG的共同作用靶點。

1.3 “中藥-成分-靶點”網絡的構建

根據以上預測結果，使用Cytoscape軟件構建“中藥-成分-靶點”關系網絡模型，節點(node)代表單味藥種類、潛在活性化合物與共同作用靶點；邊(edge)用來連接單味藥與化合物、化合物與作用靶點，展現單味藥-化合物-作用靶點之間的聯系，尋找發揮主要重要的有效活性成分。

1.4 蛋白質相互作用網絡的構建

蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction，PPI)是指從生物化學，信號轉導和遺傳網絡的角度研究化合物和疾病相關蛋白質分子之間的相關性。將“半夏-黃芩-黃連”治療HAG的潛在作用靶點導入String數據庫(https://string-db.org/)，限定研究物種為人類，獲得蛋白互作關系，導出保存為TSV格式文件。將該文件中 node1、node2 和Combinedscore 信息導入Cytoscape軟件繪制蛋白互作網絡，設置節點的大小代表其degree值，節點越大，表示其degree越大，最終獲得PPI網絡圖。

1.5 GO功能分析和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析是指對差異基因的生物途徑進行注釋及分類并進行富集統計學分析；KEGG通路富集分析是東京大學和京都大學共同研制的數據庫,可查詢通路。將“半夏-黃連-黃芩”治療HAG的潛在作用靶點導入David數據庫(https://david.ncifcrf.gov)，限定研究物種為人類，選擇Gene Ontology下的分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細胞組成(cellular component，CC)3個部分進行GO富集分析，選擇pathway分析下的KEGG pathway，設定顯著性為P<0.05，進一步尋找活性成分作用靶點顯著富集的主要功能注釋與體內通路。導出文件，對P值取負對數，得出“-lgP”，P值越小，-lgP越大，富集程度越大，反之亦然。利用Excel對GO分析和KEGG通路富集分析中的通路繪制條形圖。

根據上述所得到的核心靶點、GO通路BP、MF、CC富集分析富集程度前10的信息以及KEGG富集分析富集程度前20的通路導入Cytoscape，得到“靶點-CC-BP-MF-KEGG”網絡。

2 結果

2.1 “半夏-黃芩-黃連”藥對潛在活性化合物篩選結果

在ADME參數為OB≥30%，DL≥0.18，BBB≥-0.3，HL≥4h條件下篩選潛在活性化合物，分別得到半夏9個、黃連7個、黃芩24個，除去5個重復活性化合物，共篩選到“半夏-黃芩-黃連”藥對潛在活性化合物35個(見表1)。

表1 半夏、黃芩、黃連中潛在活性化合物信息

2.2 “半夏-黃芩-黃連”藥對治療幽門螺桿菌相關性胃炎潛在作用靶點預測

將潛在活性化合物的2D結構SDF格式上傳到Swiss Target Prediction，得到所有成分的預測靶點個2 806個，其中半夏499個、黃連399個、黃芩1 908個。通過Gene Cards、OMIM查找到HAG相關的基因227個，將潛在活性化合物和HAG共同靶點相映射。圖1中紫色、紅色、綠色、黃色圈各代表疾病幽門螺桿菌相關性胃炎(HAG)、中藥半夏(BX)、中藥黃連(HL)以及中藥黃芩(HQ)的預測靶點，相交的部分表示共同的靶點，獲得“半夏-黃芩-黃連”治療HAG的潛在作用靶點37個。

圖1 半夏、黃芩、黃連活性成分與HAG基因靶點映射Venn圖

表2 半夏、黃芩、黃連活性成分與HAG共同靶點

2.3 “中藥-成分-靶點”網絡構建與主要活性成分分析

根據上述所得到的“中藥-成分-靶點”中3種單味藥材、35個潛在活性化合物與2806個作用靶點導入Cytoscape，得到“中藥-成分-靶點”網絡圖(文中未展示)。Degree值表示鏈接該節點的條數，Degree值越大，表示該節點與其他節點的相互作用越廣泛，在網絡中起到樞紐的重要作用。Degree值前9(Degree值≥14)的化合物為5,2′-dihydroxy-6,7,8-trimethoxyflavone、黃芩新素(neobaicalein)、去甲漢黃芩素(norwogonin)、黃芩黃酮II(skullcapflavone II)、黃芩素(baicalein)、5，8，2′-三羥基-7-甲氧基黃酮(5,8,2′-trihydroxy-7-methoxyflavone)、金合歡素(acacetin)、黃芩黃酮I(panicolin)、漢黃芩素(wogonin)。主要活性成分及作用靶點見表3。

表3 “半夏-黃芩-黃連”藥對中主要活性成分及其作用靶點

2.4 蛋白質相互作用網絡分析的構建

圖2是蛋白質相互作用網絡圖，其中節點色彩越明亮代表該節點的degree值越大，同一種色彩下節點的直徑越大，代表該節點的degree值越大。蛋白質相互作用網絡圖中共涉及節點37個、邊262條，degree值≥20的靶蛋白有9個，從大到小分別為EGFR、PTGS2、STAT3、MAPK3、MAPK8、HSP90AA1、MAPK1、MMP9、MTOR，表明這些蛋白質在整個網絡中占據重要的地位，這些作用靶點在“半夏-黃芩-黃連”治療HAG中發揮重要作用。

2.5 靶點生物功能分析及“靶點-CC-BP-MF-KEGG”網絡構建

2.5.1 GO富集分析

GO通路BP富集分析結果顯示，富集基因程度前10的是肽基-絲氨酸磷酸化(peptidyl-serine phosphorylation)、細胞對機械刺激的反應(cellular response to mechanical stimulus)、NO生物合成過程的正調節(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、對壓力的反應(response to stress)、細胞凋亡過程負調節(negative regulation of apoptotic process)、應激激活MAPK級聯的調節(regulation of stress-activated MAPK cascade)、脂多糖介導的信號通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)、基因表達的正調節(positive regulation of gene expression)、肽基-蘇氨酸磷酸化(peptidyl-threonine phosphorylation)、對藥物的反應(response to drug)，見圖3。

圖2 半夏、黃芩、黃連與HAG的蛋白質相互作用網絡圖

圖3 藥物對潛在靶點GO 通路富集BP分析

GO通路CC富集分析結果顯示，富集基因程度前10的是胞質(cytosol)、膜小凹(caveola)、細胞表面(cell surface)、細胞核(nucleus)、細胞外間隙(extracellular space)、外泌體(extracellular exosome)、線粒體(mitochondrion)、頂端質膜(apical plasma membrane)、核質(nucleoplasm)、蛋白質復合體(protein complex)，見圖4。

GO通路MF富集分析結果顯示，富集基因程度前10的是蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、ATP結合(ATP binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、酶結合(enzyme binding)、激酶活性(kinase activity)、蛋白結合(protein binding)、MAP激酶活性(MAP kinase activity)、蛋白磷酸酶結合(protein phosphatase binding)、NO合酶調節劑活性(nitric-oxide synthase regulator activity)、蛋白激酶結合(protein kinase binding)，見圖5。

圖4 藥物對潛在靶點GO 通路富集CC分析

圖5 藥物對潛在靶點GO 通路富集MF分析

2.5.2 KEGG富集分析

KEGG富集分析共富集出77條通路，結果顯示，“半夏-黃芩-黃連”治療HAG的37個潛在作用靶點主要參與的關鍵通路是癌癥途徑、癌癥中的蛋白多糖、HIF-1信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、癌癥中的中心碳代謝及膽堿代謝、GnRH信號通路、VEGF信號通路、ErbB 信號通路等，見表4。

2.5.3 “靶點-CC-BP-MF-KEGG”網絡構建

根據上述所得到的核心靶點、GO通路BP、MF、CC富集分析富集程度前10的信息以及KEGG富集分析富集程度前20的通路導入Cytoscape，得到“靶點-CC-BP-MF-KEGG”網絡。其中，粉色代表作用靶點，黃色代表MF分析，紫色代表CC分析，綠色代表KEGG分析；藍色代表BP分析。可以看到“半夏-黃連-黃芩”藥對的作用靶點分布在多種細胞組分中，以胞質為主，通過多種結合方式參與生物進程，包括MAPK級聯的調節、細胞凋亡過程、脂多糖介導的信號通路、NO生物合成過程、氨基酸磷酸化、對機械刺激、壓力及藥物的反應等等(見圖6)。

表4 KEGG通路富集分析結果(-lgP前20)

圖6 “靶點-CC-BP-MF-KEGG”網絡圖

3 討論

本研究中，筆者通過設置ADME參數篩選出“半夏-黃連-黃芩”藥對潛在活性化合物35種，其中部分化合物已通過體內/外實驗研究證實其具有殺滅或抑制Hp作用。例如，黃芩素、千層紙素A可能是加味小柴胡湯抗Hp的有效物質[10]，黃芩素能夠顯著增加阿莫西林對幽門螺桿菌的抗菌活性，具有抗菌增敏劑的應用前景[11]；黃連堿可以抑制幽門螺桿菌脲酶活性[12]，與傳統三聯療法相比，含黃連素的四聯方案根除Hp治療可獲得更優的根除率[13]；而黃芩苷則可通過抗炎，促增殖并抗凋亡等減輕Hp誘導的胃黏膜上皮細胞損傷[14]。在“中藥-成分-靶點”網絡圖中發現，在潛在活性化合物中Degree值最高的化合物包括黃芩素、黃芩新素、去甲漢黃芩素、黃芩黃酮I、黃芩黃酮II、金合歡素、漢黃芩素等，提示這幾種有效化合物可能在抑殺Hp中起著更重要的作用，可能是半夏、黃連、黃芩治療Hp相關性胃炎的有效成分。但目前對于這幾種有效成分相關實驗研究較少，尚無相關作用機制報道，有待進一步實驗研究。

將潛在活性化合物和HAG共同靶點相映射，得到藥物-疾病共同作用靶點37個。其中EGFR、PTGS2、STAT3、MAPK3、MAPK8、HSP90AA1、MAPK1、MMP9、MTOR等9個蛋白在蛋白質相互作用網絡中占重要作用。目前已有研究發現，EGFR、MAPK在Hp感染到進展為胃癌的過程中發揮著重要作用[15,16]。IL-6/STAT3信號通路可被幽門螺桿菌Tipα激活，誘導胃癌細胞上皮-間質轉化(EMT)的形成[17]，而通過抑制MTOR信號通路可以有效的降低過表達CagA的Hp的侵襲能力，阻斷EMT過程[18]。MMP-9在Hp感染性胃癌組織中表達上調，與Hp共同促進胃癌的發生、發展，影響預后[19]。iNOS的表達與Hp感染相關，iNOS可能參與胃MALT淋巴瘤的發生、發展[20]。HSP90表達強度可能成為監測慢性萎縮性胃炎轉歸的生物學指標[21]。目前，前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)蛋白在Hp感染中的作用尚未見相關報道。提示“半夏-黃連-黃芩”可能通過作用以上靶蛋白來干預Hp相關性胃炎。

GO富集分析結果表明，“半夏-黃連-黃芩”藥對的作用靶點分布在多種細胞組分中，以胞質為主，通過多種結合方式參與生物進程，包括MAPK級聯的調節、細胞凋亡過程、脂多糖介導的信號通路、NO生物合成過程、氨基酸磷酸化、對機械刺激、壓力及藥物的反應等等。絲氨酸蛋白激酶MAPK是經典的細胞信號轉導通路，參與細胞內基因的轉錄調控,參與細胞的分化、轉化、增殖、凋亡等多種生物學過程。有研究認為Hp可通過激活MAPK和PI3K/Akt信號通路，上調P-Akt蛋白和P-P38蛋白水平參與胃癌細胞耐藥的形成[22]。脂多糖是Hp重要的毒力因子之一，通過TLR4，COX-2等途徑參與胃癌的發生，且可能提示胃癌的預后[23]。提示“半夏-黃連-黃芩”藥對可能通過多靶點、多通路，在Hp相關性胃炎中起到治療作用。

Hp是胃癌的Ⅰ類致癌原，約90%非賁門部胃癌的發生與Hp相關。KEGG通路富集結果表明，“半夏-黃連-黃芩”藥對作用通路主要涉及癌癥途徑、HIF-1信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、膽堿能抗炎通路、VEGF信號通路、ErbB 信號通路等。FoxO4在細胞凋亡調控和胃癌的發生發展中起重要作用，在某些癌癥病變組織中FoxO4的表達還和Hp感染密切相關[24]。膽堿能抗炎通路抗炎機制是乙酰膽堿或其他激動劑與乙酰膽堿受體結合，調控NF-κB，Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子通路，抑制炎癥介質的生成和釋放，從而發揮抗炎作用。針灸可以通過膽堿能抗炎通路，防治Hp感染致胃黏膜炎性損傷，促進胃黏膜修復[25]。可以看出，Hp可以通過多靶點、多通路導致胃炎并逐步向胃癌發生、發展，因此對于HAG的治療需要通過多成分-多靶點-多途徑的中藥發揮治療作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學分析得到“半夏-黃連-黃芩”藥對治療Hp相關性胃炎的有效化合物35個，部分化合物已有相關報道對Hp有抑制或殺滅作用；得到“半夏-黃連-黃芩”藥對治療Hp相關性胃炎作用靶點37個，參與6條主要通路，主要與抗炎與調控胃癌進程相關。此次分析體現了“半夏-黃連-黃芩”治療HAG多成分、多靶點、多途徑的治療特點，為中醫藥治療多因素導致的復雜疾病提供了新的研究思路，也為下一步實驗探究“半夏-黃連-黃芩”干預HAG的作用機制提供了理論依據和研究方向。