櫻桃核的主要成分及水溶性多糖的體外抗氧化測定

胡曉倩，吳永祥，李長江，李德寶，何玲玲，黃蘭蘭

1黃山學院生命與環境科學學院；2黃山學院化學化工學院，黃山 245041

櫻桃屬于漿果，果實皮薄肉嫩，柔軟多汁，加之采收季節氣溫較高，耐貯性差，所以市場供應期極短[1]。為解決這一問題，目前最常見最普通的就是把櫻桃加工成櫻桃汁、櫻桃酒、櫻桃醋、櫻桃果脯等深加工產品，但是櫻桃的核，作為副產物卻在加工過程中被丟棄成為廢棄物[2]。

櫻桃的可食部分(果肉)具有豐富的營養價值[3]，但櫻桃核基本成分的研究鮮有報道。Guo等[4]研究發現有些水果的非肉質部分的抗氧化活性高于肉質部分。古書記載了櫻桃核的藥用價值。近年來，學者對櫻桃核中類黃酮的提取及其功能研究較多[5]，另外，Zhang等[6]研究發現櫻桃核的脂溶性成分具有較高的營養價值和較強的抗氧化功能；Guo等[7]研究發現櫻桃核水提取物具有顯著的抗疲勞、耐缺氧及鎮痛作用。多糖是有機體必須的營養和功能物質，具有免疫調節、抗衰老、降血糖、抗腫瘤等生物活性[8]，但目前對櫻桃核中生物活性成分多糖的提取及功能的研究報道卻甚少。

本實驗系統測定了櫻桃核中灰分、蛋白質、總糖、脂質和Vc等功能成分的含量，采用水溶醇沉方法從櫻桃核中提取水溶性多糖，以Vc作為對照，評價其體外抗氧化功效。本研究旨為闡明櫻桃核的營養價值及其多糖的功效，為櫻桃加工的副產物櫻桃核“變廢為寶”的開發利用提供理論參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

1.1.1 材料

美早櫻桃購于黃山市大潤發超市。將櫻桃果肉剝離，核洗凈后粉碎過100目篩待用。

1.1.2 試劑

鹽酸、濃硫酸、抗壞血酸、草酸、2，4-二硝基苯肼、硫脲、活性炭、氫氧化鈉、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、乙醚、丙酮、酒石酸鉀鈉、2，2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、水楊酸、過硫酸鉀、沒食子酸(鄰苯三酚)、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸緩沖液(0.2 M，pH 6.6)、氯化鐵、三氯乙酸(TCA)、鐵氰化鉀、乙醇、甲醇、維生素C(Vc)等，均為分析純。

1.1.3 儀器與設備

粉碎機(浙江省永康市金穗機械制造廠)、100目篩(永康市群鑫金屬制品廠)、YP3001N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)、LPCD-E3000電熱恒溫鼓風干燥箱(上海龍躍儀器設備有限公司)、FL-1電子萬用爐(北京市永光醫療儀器有限公司)、HH-S恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫療儀器有限公司)、UV754紫外可見分光光度計(上海奧譜勒儀器有限公司)、Microfuge 20R臺式高速冷凍離心機(貝克曼庫爾特商貿中國有限公司)、索氏提取器(上海析達儀器有限公司)、TDL-5臺式低速離心機(上海安亭科學儀器廠)、SpectraMax-190型全波長酶標儀(美國Moleculear Devices公司)、R-201旋轉蒸發器(上海申勝生物技術有限公司)、pH酸度計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 櫻桃核主要成分的測定

1.2.1.1 灰分的測定

準確稱取櫻桃核粉末1 g，按照食品安全國家標準食品中灰分測定的標準和方法(GB/T 5009.4-2016)進行測定[9]。

1.2.1.2 蛋白質含量的測定

準確稱取櫻桃核粉末20 g，采用雙縮脲試劑法測定[10]。以標準品牛血清清蛋白含量X為橫坐標，A540為Y縱坐標，繪制標準曲線并得線性回歸方程Y=0.048 4X+0.003 9，R2=0.998 5，蛋白質標準品在1～8 mg時與A540呈良好的線性關系。將待測樣品溶液測得的吸光值代入蛋白質標準曲線中，計算樣品溶液的蛋白質量并換算為100 g櫻桃核樣品中的蛋白質含量g表示(g/100 g)。

1.2.1.3 可溶性總糖含量的測定

準確稱取櫻桃核粉末5 g，采用蒽酮比色法測定[11]。以標準品葡萄糖含量X為橫坐標，A620為Y縱坐標，繪制標準曲線并得線性回歸方程Y=1.503X+0.005 8，R2=0.992 9，葡萄糖標準品在10～80 μg時與A620呈良好的線性關系。將待測樣品溶液測得的吸光值代入標準曲線中，計算樣品溶液含糖量并換算為100 g櫻桃核樣品中總糖含量g表示(g/100 g)。

1.2.1.4 Vc含量的測定

準確稱取櫻桃核粉末2 g，采用2，4-二硝基苯肼比色法測定[12]。以標準品Vc含量X為橫坐標，A500為Y縱坐標，繪制標準曲線并得線性回歸方程Y=0.011 3X﹣0.001 3，R2= 0.996 7，Vc標準品在2～12 μg/mL與A500呈良好的線性關系。將待測樣品溶液測得的A500代入Vc標準曲線中，計算樣品溶液Vc含量并換算為100 g櫻桃核樣品中Vc含量mg表示(mg/100 g)。

1.2.1.5 脂質含量的測定

準確稱取櫻桃核粉末1、3和5 g，采用索氏提取法提取脂質再采用烘干法測定脂質含量[13]，并換算為100 g櫻桃核樣品中的脂質含量g表示(g/100 g)。

1.2.2 櫻桃核水溶性多糖的提取

準確稱取櫻桃核粉末5 g，采用水溶醇沉方法從櫻桃核中提取水溶性多糖，再加入Sevage試劑去除游離蛋白，得櫻桃核水溶性多糖的提取液，置冰箱4 ℃保存待用[14]。

采用蒽酮比色法測定水溶性多糖的含量并計算提取率[14]。以標準品葡萄糖含量X為橫坐標，A620為Y縱坐標，繪制標準曲線并得線性回歸方程Y=5.375X+0.020 4，R2= 0.991 2，葡萄糖標準品在0.02～0.14 mg時與A620呈良好的線性關系。將待測樣品溶液測得的吸光值(平行測定3次后取平均值)代入葡萄糖標準曲線中，計算樣品溶液的水溶性多糖含量，并按照公式1計算提取率。

櫻桃核多糖的提取率=

[(X×n×10-3)/W]×100%

(1)

式中：X為提取水溶性多糖的含量；W為櫻桃核粉末的重量(g)；n為溶液的稀釋倍數；10-3為毫克與克的單位換算因子。

1.2.3 櫻桃核水溶性多糖的體外抗氧化活性功效評價

1.2.3.1 總還原力的測定

采用普魯士藍法[15]，用0.03～0.05 mg/mL的Vc溶液做對照。

1.2.3.2 對DPPH自由基清除能力的測定

采用DPPH法[16,17]，用0.1～0.4 mg/mL的Vc溶液做對照。

1.2.3.3 對羥基自由基清除能力的測定

采用水楊酸比色法等[18,19]，用0.1～0.4 mg/mL的Vc溶液做對照。

1.2.3.4 對ABTS自由基清除能力的測定

采用ABTS法等[20]，用0.05～0.3 mg/mL的Vc溶液做對照。

1.3 實驗數據處理

以上實驗平行3次，結果表示為平均值±標準差。采用SPSS18.0統計分析軟件對數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Duncan多重比較法分析樣本間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 櫻桃核主要成分的檢測結果

美早櫻桃核主要成分(灰分、蛋白質、可溶性多糖、Vc和脂類物質)的含量見表1。由表1可知，蛋白質含量最高，為18.80±0.30 g/100 g，與大紫紅櫻桃核中蛋白質含量17.62±0.30 g/100 g相當，但略低于嶗山紅櫻桃核的蛋白質含量24.86±0.31 g/100 g[21]。脂質含量次之，為8.97±0.58 g/100 g，高于大紫紅櫻桃核中脂質含量6.11±0.14 g/100 g和嶗山紅櫻桃核中脂質含量3.18±0.35 g/100 g[21]；本實驗測得美早櫻桃核中可溶性總糖含量為4.96±0.14 g/100 g，Zeng等[21]實驗測得大紫紅櫻桃核中還原糖含量為3.43±0.18 g/100 g，嶗山紅櫻桃核中還原糖含量為2.42±0.078 g/100 g。美早櫻桃核中灰分含量為1.49±0.08 g/100 g，高于大紫紅櫻桃核中灰分含量0.69±0.01 g/100 g和嶗山紅櫻桃核中灰分含量0.94±0.028 g/100 g[21]。Vc在美早櫻桃核中的含量為27.55±0.99 mg/100 g。美早櫻桃、嶗山紅櫻桃和大紫紅櫻桃是3個不同品種，櫻桃核基本成分含量的差異可為櫻桃核“變廢為寶”不同的開發利用方向提供理論參考。

表1 櫻桃核的主要成分檢測結果

2.2 櫻桃核水溶性多糖的含量和提取率

在620 nm測定吸光度值，櫻桃核水溶性多糖溶液的吸光度A=0.582，代入“1.2.2”中的回歸方程，得到櫻桃核多糖的含量為0.104 5 mg。按照公式1計算得櫻桃核多糖的提取率為2.09%。

2.3 櫻桃核水溶性多糖的總還原力

還原能力強的物質因其化學本質為還原劑，將會是良好的電子供體，研究發現總還原力與物質的抗氧化活性呈正相關[22]。一般情況下具有較強還原能力的物質能夠把Fe3+還原成Fe2+，根據顯色反應可以判斷其還原程度，反應后吸光度越大的物質其還原能力越強[23]。由表2可知，隨櫻桃核水溶性多糖濃度的增加，總還原力也增加，且具有統計學顯著差異(P<0.05)。當櫻桃核水溶性多糖溶液濃度為0.40 mg/mL時，其總還原力(吸光值為0.25±0.02)為37.62±3.67 mg Vc/g。實驗數據表明櫻桃核水溶性多糖具有較好的體外抗氧化能力，接下來進行了櫻桃核水溶性多糖對DPPH、ABTS和羥基自由基清除能力的測定實驗。

表2 櫻桃核水溶性多糖的總還原力

注：同列不同字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05)，下同。

Note:Different letters in the same column showed significant differences(P<0.05),the same below.

2.4 櫻桃核水溶性多糖溶液對DPPH·清除能力

由表3可知，櫻桃核水溶性多糖溶液對DPPH·的清除能力表現出明顯的劑量效應，在實驗濃度范圍內，隨著水溶性多糖濃度的增加，對DPPH·的清除能力也呈線性增加，且具有統計學顯著差異(P<0.05)。櫻桃核水溶性多糖溶液濃度為0.64 mg/mL時，對DPPH·清除率達72.94%。櫻桃核水溶性多糖溶液和Vc對DPPH·清除作用的IC50數值分別為0.31和0.19 mg/mL，說明櫻桃核水溶性多糖具有較好的DPPH·體外清除能力。

表3 櫻桃核多糖對DPPH自由基的清除率

2.5 櫻桃核水溶性多糖對ABTS自由基清除能力

由表4可知，在實驗濃度范圍內，隨著水溶性多糖質量濃度的增加，櫻桃核水溶性多糖溶液對ABTS·的清除能力也呈線性增加，且具有統計學顯著差異(P<0.05)。當櫻桃核水溶性多糖溶液濃度為0.40mg/mL時，對ABTS·清除率達64.29%，櫻桃核水溶性多糖溶液和Vc對ABTS自由基清除作用的IC50分別為0.32 和0.13 mg/mL，說明櫻桃核水溶性多糖具有一定的ABTS自由基體外清除能力。

表4 櫻桃核多糖對ABTS自由基的清除率

2.6 櫻桃核水溶性多糖溶液對羥基自由基的清除能力

由表5可知，在實驗濃度范圍內，隨著水溶性多糖質量濃度的增加，櫻桃核水溶性多糖溶液對羥基自由基的清除能力也呈線性增加，且具有統計學顯著差異(P<0.05)。0.40 mg/mL櫻桃核水溶性多糖溶液對羥基自由基清除率達62.88%，櫻桃核水溶性多糖溶液和Vc對羥基自由基清除作用的IC50分別為0.34和0.28 mg/mL，IC50數值表明櫻桃核水溶性多糖對羥基自由基的清除能力與Vc非常接近。因此，櫻桃核水溶性多糖對羥基自由基具有較好的清除效果。

表5 櫻桃核多糖對羥基自由基的清除率

3 結論與討論

灰分包含著人體所需的無機鹽和礦質元素；蛋白質、可溶性總糖、脂質是活性成分，促進生物體結構和功能的穩定；Vc不僅是人體必須的水溶性維生素，而且是重要的抗氧化劑，可以預防牙齦萎縮出血，治療口腔潰瘍，還具排毒美白、增強人體免疫力的作用[24]。本實驗結果表明美早櫻桃核含多種功能成分，其中蛋白質含量最高，脂質和多糖次之，再其次是灰分和Vc，美早櫻桃核具一定的營養價值。

植物多糖具有增強機體免疫力、抗氧化、抑菌性、降血糖等多種生物活性，且對人體副作用小[25,26]。本實驗采用水溶醇沉方法從櫻桃核中提取水溶性多糖，研究了櫻桃核水溶性多糖的總還原力及對DPPH、ABTS、羥基自由基的清除能力。實驗結果表明，櫻桃核水溶性多糖具有較強的還原能力和對DPPH、ABTS、羥基自由基的清除能力，在實驗濃度范圍內，抗氧化能力與水溶性多糖質量濃度呈正相關并有統計學的顯著差異。櫻桃核水溶性多糖對DPPH、ABTS、羥基自由基清除作用的IC50值分別為0.31、0.32和0.34 mg/mL，表明櫻桃核水溶性多糖的體外清除自由基功效非常穩定。

目前，櫻桃產業利潤大部分來源于櫻桃果實的當季銷售，但櫻桃耐貯性不強，因此有了櫻桃酒、果汁、果脯、果醋等延續加工的產品，在這些產品加工過程中，大量櫻桃核由于外殼堅韌而成為被丟棄的加工副產物，因此，“變廢為寶”開發加工丟棄的副產物櫻桃核，成為延伸櫻桃產業鏈提高櫻桃產業利潤的發展方向。Zhang等[27]通過響應面優化超聲波輔助酶解櫻桃核，得到了對·OH具有清除能力的抗氧化多肽。Sun[28]通過優化快速溶劑萃取工藝制備了類黃酮，具有優于Vc的抗氧化能力。Ren[29]研究顯示甜櫻桃核及其粗提物中含有總多酚、總多糖、總黃酮、總單寧和脂肪酸等活性成分，具有較好的抑菌和抗氧化生物活性。Zhang等[6]研究發現櫻桃核的脂溶性成分具有較高的營養價值和較強的抗氧化功能；Gong等[30]研究發現櫻桃核乙醇提取物具有體外抗氧化和降糖降脂的作用。本實驗研究表明，美早櫻桃核的水溶性多糖具有較好且穩定的體外抗氧化功效。由此可見，櫻桃核具有多種生物活性成分，且具有較好的抗氧化、抑菌、抗疲勞等生理功能。櫻桃核活性成分提取物具有天然、安全、有機、綠色等特點，作為抗氧化或抑菌的天然添加劑，符合“純天然、無刺激”的消費需求，可加強在食品、飲品、化妝品等產業領域的開發利用，從而延伸櫻桃產業鏈和提升櫻桃的利潤空間。

本實驗研究表明，加工副產物櫻桃核的水溶性多糖具有較好且穩定的體外抗氧化活性，下一步將對水溶性多糖進行分離純化和成分鑒定，以期為櫻桃核的藥用保健功能及其多糖的抗氧化活性闡明機制。