降尿酸復方抗痛風的藥效學和急性毒性研究

王 芳，曹 靜，李 陽，白 靜，徐海波，國錦琳

成都中醫藥大學 西南特色中藥資源省部共建國家重點實驗室 中藥材標準化教育部重點實驗室，成都 611137

痛風和高尿酸血癥是人類常見的代謝紊亂疾病，截至2017年，痛風已成為我國第二大代謝性疾病，僅次于糖尿病[1-4]。我國部分地區普通人群高尿酸血癥的患病率已經增至19%左右[5,6]。臨床常用的降低尿酸藥物長期服用可能會對胃腸道和肝腎功能造成不良反應，整體調理、療效持久、副作用小的中醫藥治療方藥研究成為研究熱點[2]。Zhang[7]、Huang[8]、Zhao[9]、Min[10]、Zou[11]等分別使用四四二合方加減、金匱腎氣丸、通督活血湯、土精方、降酸消脂膠囊研究降尿酸能力，發現有明顯的降尿酸活性。加味活血四妙湯、萆薢除痹湯、泄濁除痹湯等復方藥劑均已有研究表明具有降尿酸療效[12]。但上述處方均為藥物成分，安全性方面的問題使其在研究后的發展上周期更長。課題組從成都中醫藥大學附屬醫院臨床處方中首次整理發現了此療效顯著且藥食同源的復方，以模型動物作為研究對象，研究此降尿酸復方的藥效學與安全性，為后續降尿酸保健食品與健康食品開發奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 主要試劑和藥品

降尿酸復方由葛根、烏梅、昆布、芹菜、薏仁組成，由上海天源植物制品有限公司水提噴霧干燥折合15∶1的提取率完成，推薦使用劑量為一日2 g；阿司匹林腸溶片(云南白藥集團股份有限公司)，別嘌呤片(合肥久聯制藥有限公司)，氧嗪酸鉀和尿素氮含量檢測試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)，大、小鼠普通飼料(成都達碩實驗動物有限公司)，肌酐測定和尿酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，阿拉伯膠和重鉻酸鉀(成都市科隆化學品有限公司)，蘇木素染液和伊紅染液(珠海貝索生物技術有限公司)，多聚甲醛(成都市科龍化學品有限公司)。

1.2 主要儀器

轉輪式切片機(徠卡微系統股份公司)，包埋機BMJ-Ⅲ、全自動封閉式組織脫水機TSJ-Ⅱ、病理組織漂烘儀PHY-Ⅲ(常州市中威電子儀器有限公司)，冷凍離心機AllegraX-22R(美國貝克曼庫爾特有限公司)，RB-200智能熱板儀(成都泰盟軟件有限公司)，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)，全波長多功能酶標儀(賽默飛世爾科技公司)，數碼顯微鏡BA400Digital(麥克奧迪實業集團有限公司)，萬分之一電子天平Quintix224-1CN(賽多利斯科學儀器有限公司)，2mm打孔器(海德創業生物科技有限公司)。

1.3 實驗動物

六十只的Wistar大鼠，雌雄各三十只，一百八十只的昆明種小鼠，雌雄各九十只，大鼠與小鼠均為SPF級別。成都達碩實驗動物有限公司提供實驗所需動物(許可證號：SCXK(川)2015-030)，飼養室條件：室溫(20±2)℃，飼養室內50%～60%相對濕度，自由飲食普通飼料及水。

2 方法

2.1 降尿酸復方對大鼠高尿酸血癥的影響

將重量在180～220 g的60只大鼠，隨機分為6 組，包括正常對照組(等量的生理鹽水)、模型對照組(等量的生理鹽水)、陽性對照組(0.027 g/kg別嘌呤片懸浮液)、降尿酸復方低、中、高劑量組(0.18、0.36、0.72 g/kg，分別為臨床劑量等效、2倍、4倍)，每組10只，使用5% 阿拉伯膠溶液灌胃正常對照組，0.75 g/kg氧嗪酸鉀灌胃造模實驗組[4,13]。各組按上述給藥方案連續給藥4周，后按試劑盒操作測定大鼠血清中尿酸、肌酐、尿素氮的水平。肝、腎組織病理切片采用HE染色法進行染色，光學顯微鏡400倍鏡下觀察并拍照記錄，察看各組織病理變異情況。

2.2 降尿酸復方的抗炎實驗

昆明種小鼠50只，隨機分為5組：降尿酸復方低、中、高劑量組、陽性對照組和正常對照組，每組10只，其中正常對照組灌胃等體積的蒸餾水，陽性對照組灌胃0.25 g/kg阿司匹林懸浮液，低、中、高劑量降尿酸復方組分別灌胃0.26 g/kg(臨床等效劑量)、0.52 g/kg(臨床等效劑量的2倍)、1.04 g/kg(臨床等效劑量的4倍)，連續給藥一周，20 μL二甲苯涂抹小鼠右耳正反兩面，1 h后處死小鼠，用打孔器在小鼠兩耳相同部位打下耳片，稱重并計算各組小鼠的耳腫脹度和藥物的抑制率[4,14]。

耳腫脹度=右耳片重-左耳片重

抑制率=[(正常組平均腫脹度-給藥組平均

腫脹度)/正常組平均腫脹度]×100%

2.3 降尿酸復方鎮痛實驗

小鼠化學刺激痛：分組情況以及各組的給藥方式和給藥劑量同2.2中的描述，連續給藥七天，按給藥順序腹腔注射200 μL 0.6%(質量分數)冰醋酸溶液，記錄15 min內小鼠扭體情況，表現為腹部內凹，腹前壁緊貼隆底、臀部歪扭和后肢伸張，呈一種特殊姿勢，記錄扭體次數及持續的時間并計算鎮痛率[4,14]。

鎮痛率=[(正常組平均扭體次數-給藥組

平均扭體次數)/正常組平均扭體次數]×100%

小鼠熱板刺激痛：昆明種小鼠50只，喂養3天后，在30 s內，將50只雌性小鼠按痛閾值，分組情況以及各組的給藥方式和給藥劑量同“2.2”中的描述。連續七天灌胃，最后一次灌胃前，檢測小鼠痛閾值，灌胃后記錄小鼠0.5、1、1.5、2 h時的痛閾值[14]。

2.4 復方急性毒性實驗

最終選擇使用最大給藥量實驗來評價復方的臨床安全性，是因為小鼠給藥體積與藥物濃度限制無法測量半數致無量。使用蒸餾水溶解并確定此復方最大給藥量實驗濃度為1 g/mL，此濃度為復方能溶且可順利通過小鼠灌胃針頭的最大濃度。

將18～22 g重量的20只健康昆明種小鼠，隨機分成正常組和藥物組，其中每組內重量趨勢大致一致，雌雄鼠只數相同。實驗前，小鼠禁食12 h(不禁水)，實驗的24 h內，藥物組小鼠灌胃降尿酸復方2次，間隔8 h，給藥濃度是1 g/mL，以每只小鼠的體重為依據，灌胃的最大給藥體積是0.4 mL/10 g(臨床等效劑量的160倍)，完成給藥后，連續觀察3天[15]，未觀察到有小鼠死亡或明顯中毒癥狀，經過解剖未在肝臟，心臟，脾臟等主要臟器上觀察到病變。

按照上述預實驗分組與給藥情況進行最大給藥量實驗，觀察并記錄兩周內小鼠精神及健康狀況，包括毛色、飲食、體重、活動和有無死亡等情況[16]。

2.5 數據統計

3 實驗結果

3.1 降尿酸復方對大鼠高尿酸血癥的影響

在血肌酐水平上看，各組含量均無明顯變化，推斷肌酐的含量可能與高尿酸血癥沒有直接的關聯。

在大鼠血尿酸指標上看，相較于正常對照組，模型組大鼠尿酸的含量明顯更高且具有顯著性(P<0.01)，表明本次實驗的高尿酸血癥模型造模成功。相較于模型組，降尿酸復方低、中、高劑量三組血尿酸水平顯著更低(P<0.01)，此結果表明該藥物具有降血清尿酸作用。別嘌呤作為陽性藥物，給予別嘌呤后大鼠血清尿酸的含量明顯降低，且從表1可以看出其降尿酸作用更強。

在尿素氮水平上看，藥物中、高劑量組均有降低血清尿素氮含量的作用。與正常組相比，模型組大鼠顯著更高(P<0.01)，且模型組大鼠尿素氮水平顯著高于復方中劑量組(P<0.05)和高劑量組(P<0.01)，低劑量組可能由于濃度低達不到作用效果，未表現出顯著差異。

表1 模型大鼠藥物灌胃后肌酐、血尿酸、尿素氮水平

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note:Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with control,#P<0.05,##P<0.01.

使用顯微鏡觀察大鼠肝、腎組織病理切片(400×)，正常組均未出現明顯的自發性病變；模型組病變相對嚴重，肝門管區和血竇有輕微的炎性細胞浸潤，部分肝細胞有不同程度的變性；陽性對照組和藥物組有輕微肝細胞變性或炎性細胞浸潤，與模型組相比腎臟病變較輕，各組無明顯差異，見圖1與圖2。

3.2 降尿酸復方抗炎實驗

陽性藥物組、復方低、中、高劑量組與正常組相比有抗炎效果，腫脹度指標具有顯著差異(P<0.01)，顯示該復方一定程度下抑制小鼠耳腫脹，具體數據見下表。

3.3 降尿酸復方鎮痛實驗

小鼠化學刺激實驗結果表明：復方低、中、高劑量組能顯著減少小鼠的扭體次數(P<0.01)，一定程度下影響扭體反應潛伏期，但效果不如陽性藥物組明顯，具體數據見表3。

小鼠熱板刺激痛實驗，由表4可知，低劑量組小鼠在灌胃藥物后的第60 min時，表現出明顯增加的痛閾值，90 min和120 min時的痛閾值，與給藥前相比具有顯著差異(P<0.01)；阿司匹林組、中、高劑量組隨時間增加，小鼠的痛閾值都有明顯地增加(P<0.01)。說明降尿酸復方可以明顯的使小鼠的痛閾值增加，具有鎮痛作用。

圖1 模型大鼠灌胃復方后肝組織切片

表2 降尿酸復方的抗炎作用

注：與正常組比較，*P<0.01。

Note:Compared with control,*P<0.01.

3.4 復方急性毒性實驗

與正常組相比，藥物組的小鼠活躍程度明顯下降，精神狀態不佳，在1 h后，出現覓食行為，第二天，藥物組的小鼠活動自由，14天內，無死亡情況發生，也未發現明顯中毒癥狀。對這次實驗的小鼠進行解剖，觀察其主要臟器，如肝臟、心臟、脾、肺和腎，均未發現異常狀況。觀察期間小鼠體重變化如圖3所示，可以看出，給藥后第2天，正常組小鼠的體重增長率高于復方藥物組，可能是復方藥物組給藥量太大，小鼠消化負擔加重，影響其正常飲食，一天緩沖適應后，兩組小鼠的體重增長趨向一致。

表3 降尿酸復方對小鼠化學刺激痛的影響

注：與正常組比較，*P<0.01。

Note:Compared with control,*P<0.01.

表4 降尿酸復方對小鼠熱板刺激痛的影響

注：與正常組比較，*P<0.01。

Note:Compared with control,*P<0.01.

圖3 小鼠體重變化圖

最大給藥量實驗中，降尿酸復方的最大給藥量為40 g/kg(小鼠)，臨床上此復方推薦用量為29 mg/kg(成人)，使用下述計算公式如下：

通過該公式計算，降尿酸復方的小鼠最大給藥量能達到成人用量的1 379倍。

4 討論

近年來降尿酸復方的研究不斷增加，Wang等[16]以成人十倍劑量降尿酸復方與西藥組分別灌胃SD大鼠，發現降尿酸復方能健脾補腎、化痰祛瘀，具有多元靶點的降尿酸作用，減輕模型大鼠氧化應激及炎癥損傷。Liu[17]報道了平臥菊三七復方片劑通過抗炎止痛發揮抗痛風藥理作用，具有顯著降尿酸作用及一定程度的護腎效果。Wang等[18]使用劉延慶教授長期臨床運用的復方水煎劑，以10 g/(kg·d)劑量給藥，研究表明該復方能明顯降低痛風相關免疫炎癥因子(IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-13、TNF-α)的水平，對痛風相關的炎癥因子具有明顯的抑制作用，短期肝腎毒性檢測未見明顯的肝腎組織損傷。大多數已報道的降尿酸復方均有涉及腎臟損傷，但未具體給出較為全面的安全性研究。此實驗研究了受試復方作用于高尿酸血癥模型動物的療效并評價其在臨床用藥上的安全性，結果表明受試復方具有明顯降尿素氮和尿酸作用，不損傷肝腎組織，且一定程度上減輕了高尿酸血癥引起的肝、腎組織病變，還可以減少模型小鼠的扭體次數，增加痛閾值，明顯降低小鼠耳腫脹的腫脹度，綜上所述，降尿酸復方可以明顯降低體內尿酸含量，抑制炎癥，緩解疼痛。

已報道的降尿酸復方大多為非藥食同源成分，如土茯苓、淡竹葉、王不留行、車前子、粉萆薢、虎杖等藥物，其中土茯苓肝腎陰虧者慎服，淡竹葉體虛有寒者、孕婦禁服，粉萆薢腎陰虧虛、遺精滑精者慎用等。雖然配伍發揮減毒增效作用，但是長期服用還是具有安全隱患。安全性評價實驗結果可以看出本研究受試復方毒性極小或不具有毒性。最大給藥量實驗測得降尿酸復方的最大給藥量可達到相當于成人用量的1 379倍，遠超于100倍的安全指標(實驗小鼠的最大耐受劑量達到成人口服劑量的100倍以上)，且從復方成分來源上看，復方中的葛根、烏梅、昆布、芹菜和薏仁均為藥食同源物，不含有毒性或毒性較大成分，正常的服用降尿酸復方在理論上是不會出現明顯的中毒現象，可以認為它是安全、無毒、可靠的。

本研究表明降尿酸復方能抗炎鎮痛，具有良好降尿酸效果，并且此復方中成分均可藥食兩用，經過最大給藥量實驗表明此復方相較于其他降尿酸復方或藥物正常使用的安全性更高。課題組后期將深入降尿酸復方質量控制指標的研究，為降尿酸復方治療高尿酸血癥和痛風提供指控標準。

綜上，該降尿酸復方安全無毒，具有鎮痛消炎和降尿酸作用，后續有開發為保健食品和健康食品的潛力。