響應面法優化豫西山茱萸葉黃酮的提取及其抑菌和抗氧化活性

孫建瑞，趙君峰，原江鋒，何 容，王大紅*

1河南科技大學食品與生物工程學院 河南省食品微生物工程技術研究中心，洛陽 471023；2云南省供銷合作社科學研究所，昆明 650223

山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)屬于山茱萸科山茱萸屬植物，主要分布于河南、山西、陜西等地。中藥山茱萸是山茱萸成熟干燥的果實，也稱山萸肉，最早載于《神農本草經》，味酸澀、微溫、平，入肝、腎二經，具有補益肝腎、收澀固脫的作用，對治療眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽痿遺精、小便頻數、心搖脈散、大汗虛脫、內熱消渴等癥有功效[1]。山茱萸果肉是我國藥食同源的傳統中藥材，是中醫方劑中的常用藥，在我國應用廣泛[2]。現代研究發現山茱萸成分復雜多樣，不僅含有豐富的環烯醚萜類、皂苷、多糖、鞣質類、有機酸、黃酮、酯類等活性成分，還含有多種人體必需的微量元素[3-5]。現代藥理研究還發現山茱萸不僅在保肝、抗炎、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、保護心肌、降血糖、增強免疫力、調節心率等方面有功效，而且對治療老年癡呆和不孕癥有療效[6-8]。

黃酮類化合物具有止咳、抗抑郁、抗氧化、抗癌、抗炎、抗衰老及保護心血管、免疫調節等生物活性[9]。Shu等[10]發現山茱萸總苷對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、白菜軟腐病菌、姜瘟病菌、柑桔潰瘍病菌都具有較強的抑菌效果。山茱萸中鑒定出的黃酮類化合物主要有花色苷、黃酮醇兩類和二氫黃酮類，包括3-O-β-吡喃型半乳糖苷-飛燕草苷元、3-O-β-吡喃型半乳糖苷-矢車菊苷元、3-O-β-吡喃型半乳糖苷-天竺葵苷元、山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮素等[11,12]。Seeram等[12]研究發現山茱萸3-O-β-吡喃型半乳糖苷-飛燕草苷元、3-O-β-吡喃型半乳糖苷-矢車菊苷元和3-O-β-吡喃型半乳糖苷-天竺葵苷元均具有很強的抗氧化活性。Ding等[13]研究表明山茱萸的黃酮提取液對超氧陰離子和羥自由基具有較強的清除能力，對豬油也有顯著的抗氧化效果。Bolleddula等[14]研究發現山茱萸中的花色苷能夠促進體內胰島素的分泌，降低血糖水平，抑制肥胖的產生。

山茱萸傳統的藥用部分為其果實，而其果核和葉資源豐富，卻基本都被丟棄。近年來，已有科研工作者對山茱萸果核進行研究，發現山茱萸果核富含鞣質類、不飽和脂肪酸、熊果酸、沒食子酸、氨基酸、維生素等活性成分，同樣在抗炎、抑菌、抗腫瘤、心肌保護、抗衰老、抗疲勞等方面有功效[15,16]。然而，目前還未見有關山茱萸葉活性成分研究的報道。本研究通過響應面法對豫西山茱萸葉黃酮的提取工藝進行優化，并對其體外抑菌和抗氧化活性進行研究，以期為山茱萸葉資源的綜合開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山茱萸葉采自河南省嵩縣山區，經烘干粉碎后，過40目篩備用；受試菌種由河南科技大學食品與生物工程學院提供。

實驗用蘆丁(CAS號：153-18-4)天津市德恩化學試劑有限公司；硫酸亞鐵、鄰苯三酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、無水乙醇、過氧化氫、二丁基羥基甲苯(BHT)等化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器公司)；HX-IID超聲波細胞破碎儀(上海滬析實業有限公司)；H2050R臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 山茱萸葉黃酮的提取

定量稱取粉碎后的山茱萸葉1.0 g，置于索氏提取器中用石油醚進行脫脂，晾干；加入適量乙醇溶液作為提取介質，混合均勻后，超聲波破碎；經過濾濃縮后，用50 mL的容量瓶進行定容，測定其在510 nm波長處的吸光值。

1.3.2 山茱萸葉黃酮提取得率的測定

以蘆丁作為標準品，采用NaNO2-Al(NO2)3-NaOH法繪制標準曲線[17]，檢測山茱萸葉黃酮的濃度。黃酮濃度的計算采用線性方程：Y=9.004 9X-0.014 9，R2=0.997 3。黃酮提取得率的計算公式如下：

式中：C為提取液樣品中黃酮的濃度(mg/mL)，V0為定容后提取液樣品的體積(mL)，m為山茱萸葉的質量(mg)。

1.3.3 單因素試驗

分別考察超聲功率(100、200、300、400、500、600 W)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL/g))、乙醇體積分數(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)和提取時間(5、10、15、20、25、30、35、40 min)對山茱萸葉中黃酮提取得率的影響。

1.3.4 中心組合試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，對超聲功率(X1)、液料比(X2)、乙醇體積分數(X3)和提取時間(X4)進行四因素三水平的中心組合試驗設計，各個因素的水平見表1。

1.3.5 抑菌實驗

將受試菌分別接種在對應的細菌和真菌培養基上，置于恒溫培養箱中進行培養(真菌28 ℃，2天；細菌37 ℃，1天)，然后用接種環挑取活化后的菌種一環于滅菌的蒸餾水中，混合均勻后制成菌懸液。

抑菌試驗采用濾紙片法[18]：將滅菌過的直徑6 mm的圓形濾紙片烘干后，浸泡于制備好的山茱萸葉黃酮提取液中12 h，然后晾干；然后將制備好的各種菌懸液(200 μL)置于相應的固體培養基表面，涂布均勻；用滅過菌的鑷子將浸泡好晾干后的濾紙片貼在培養基表面，之后將細菌放在37 ℃培養箱中培養18～24 h，真菌放在28 ℃培養箱中培養48～72 h，觀察并測量抑菌圈直徑；用61%的乙醇溶液作為空白對照。

表1 中心組合試驗設計因素及水平

1.3.6 DPPH自由基清除能力測定

參照Yu等[19]的方法：取質量濃度不同的山茱萸葉黃酮提取液1.0 mL，加入0.004%的DPPH溶液4 mL，充分混勻，黑暗下靜置30 min，以無水乙醇作空白對照，相應濃度的BHT作陽性對照，于517 nm處測定其吸光值。每一樣品平行測3 次，取其平均值。清除率公式可表示為：

式中：A1為樣品或者陽性對照的吸光值；A2為空白對照的吸光值。

1.3.7 羥基自由基清除能力測定

參照Yu等[19]的方法：在試管中分別加入0.4 mL pH 7.4的PBS、0.25 mL重蒸水、0.15 mL 5 mmol/L的鄰二氮菲溶液和0.5 mL 7.5 mmol/L的FeSO4后混合均勻。然后加入1.0 mL不同質量濃度的山茱萸葉黃酮提取液，最后加入1%的過氧化氫溶液0.1 mL，37℃水浴保溫60 min，536 nm處測定吸光值。陽性對照采用對應濃度的BHT，損傷管中不加樣品，對照管中樣品和過氧化氫都不加，空白管中不加過氧化氫。每一樣品平行測3 次，取其平均值。清除率公式可表示為：

式中A樣品為樣品管的吸光值、A損傷為損傷管的吸光值、A對照為對照管的吸光值、A空白為空白管的吸光值。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對山茱萸葉黃酮提取得率的影響

山茱萸葉黃酮的提取得率隨著超聲功率的增加先迅速升高后逐漸降低，當超聲功率為300 W時，提取得率達到最高的3.46%；之后提取得率逐漸降低(圖1)。超聲波的機械和空化效應會破壞山茱萸葉細胞的細胞壁和細胞膜結構，從而使黃酮更容易溶出，且隨著超聲功率的增加細胞壁被破壞地越充分，黃酮溶出越充分；但過高的超聲功率可能會使黃酮的結構發生變化，而且可能使黃酮和其他成分之間產生反應，從而導致黃酮提取得率下降[20]。因此，超聲功率選擇300 W。

圖1 超聲功率對山茱萸葉黃酮提取得率的影響

2.1.2 液料比對山茱萸葉黃酮提取得率的影響

山茱萸葉黃酮的提取得率隨著液料比的增加逐漸升高，當液料比為30∶1(mL/g)時提取得率為3.92%，之后黃酮的提取得率逐漸趨于穩定(圖2)。這可能是因為山茱萸葉中黃酮總的溶出量會隨著提取液用量的增加而升高，液料比越大，提取液中黃酮的濃度就越低，傳質的推動力就越大，提取得率就越高[21]。但過高的液料比不僅會增加原料和試劑的用量，造成浪費，使成本升高，而且會增加后處理工序的困難。因此，液料比選擇30∶1(mL/g)，既可以確保高的提取得率，又可以減少提取溶液的用量。

2.1.3 乙醇體積分數對山茱萸葉黃酮提取得率的影響

隨著乙醇體積分數的增大，山茱萸葉黃酮的提取得率先迅速升高后逐漸降低；提取得率在乙醇體積分數為60%時達到最高，為4.25%(圖3)。這可能是因為山茱萸葉細胞的溶脹會隨著乙醇體積分數的升高而增強，從而使提取溶劑能夠有效地滲透進細胞，導致提取得率增加；但當乙醇體積分數超過60%后，提取溶劑的極性降低，此時部分醇溶性、色素等雜質的溶出會增加，從而競爭性結合提取溶劑，導致黃酮類化合物的提取得率降低[22]。因此，乙醇體積分數選擇60%較為合適。

圖2 液料比對山茱萸葉黃酮提取得率的影響

圖3 乙醇體積分數對山茱萸葉黃酮提取得率的影響

2.1.4 提取時間對山茱萸葉黃酮提取得率的影響

由圖4可知，在提取時間5～20 min內，山茱萸葉黃酮的提取得率隨提取時間的增加而增加，當提取時間為20 min時，提取得率達到最大值4.52%；之后，提取得率隨著提取時間的增加呈下降趨勢。提取時間越長，越有利于山茱萸葉黃酮的溶出，因此在一定時間內提取得率呈升高趨勢；但提取時間過長會導致雜質的溶出量增加，不僅會與提取溶劑競爭性結合，而不溶性雜質也可能會吸附黃酮類化合物，從而導致黃酮提取得率的降低。因此，提取時間選擇20 min。

圖4 提取時間對山茱萸葉黃酮提取得率的影響

2.2 山茱萸葉黃酮提取的中心組合試驗結果與分析

2.2.1 中心組合試驗結果

采用Design expert 軟件設計四因素三水平的中心組合試驗，以山茱萸葉黃酮的提取得率作為響應值，27個試驗組合的設計方案及結果見表2。

表2 中心組合試驗方案與結果

續表2(Continued Tab.2)

試驗號No.因素水平FactorandlevelX1超聲功率UltrasonicpowerX2液料比SolventtosolidratioX3乙醇體積分數EthanolconcentrationX4提取時間Extractiontime黃酮提取得率Extractionrateofflavonoids(%)8-20004.68±0.19900025.97±0.271000006.13±0.2911-11115.79±0.261202005.69±0.251300205.49±0.2614-1-1-1-15.08±0.2115111-14.60±0.18161-1-1-14.54±0.2117-1-1115.23±0.2318-1-11-14.87±0.201920004.08±0.182011-1-14.62±0.212111-115.09±0.2322-11-1-14.52±0.222300006.26±0.312400006.34±0.3025-111-15.42±0.24261-1-115.32±0.23270-2005.24±0.23

2.2.2 模型的建立及顯著性分析

采用Design-Expert軟件對實驗結果進行分析，得到的擬合方程如下：

Y=7.00-0.23X1+0.11X2-0.011X3+0.28X4+0.055X1X2-0.17X1X3+0.054X1X4+0.23X2X3+0.000X2X4-0.020X3X4-0.57X12-0.27X22-0.26X32-0.25X42

同時，利用分析軟件對回歸方程的方差分析結果如表3所示。

表3 方差分析表

續表3(Continued Tab.3)

方差來源Source離差平方和Sumofsquares自由度df均方MeansquareFP顯著性SignificanceX2X30.6810.6817.010.0014??X2X40.00010.0000.0001.0000X3X44.900E-00314.900E-0030.120.7324X125.4915.49137.34<0.0001??X221.1911.1929.760.0001??X321.2211.2230.400.0001??X421.0211.0225.520.0003??殘差Residual0.48120.040失擬項Lackoffit0.46100.0464.070.2131Notsignificant純誤差Pureerror0.02220.011

注：*差異顯著，P<0.05；**差異極顯著，P<0.01。

Note:*Significant,P<0.05;**Very significant,P<0.01.

圖5 各因素交互作用對山茱萸葉黃酮提取得率的影響

由表3可以看出，該模型是高度顯著的(P<0.01)。同時，模型中X1、X2、X4、X1X3、X2X3、X12、X22、X32、X42的P值均小于0.05，說明它們都是顯著的，即它們對山茱萸葉黃酮提取得率的影響均顯著。該模型的失擬項不顯著(P﹥0.05)，說明模型選擇合適。

另外，該模型相關系數R2為0.951 9，能夠解釋95.19%的實驗結果，說明該模型相關度很好；模型的變異系數為3.86%，說明實驗操作可靠，可以準確反映實驗結果。總之，該模型擬合度好，實驗誤差小，能夠用來分析和預測山茱萸葉黃酮的提取得率。

四個因素中液料比對山茱萸葉黃酮提取得率的影響顯著(P<0.05)，超聲功率和提取時間對提取得率的影響極顯著(P<0.01)，四個因素對提取得率的影響順序依次為：提取時間>超聲功率>液料比>乙醇體積分數。

2.2.3 響應曲面分析

為了進一步分析各個因素之間的交互作用及確定最佳實驗點，通過Design-expert軟件繪制響應曲面圖以評價各個因素對山茱萸葉黃酮提取效果影響的兩兩交互作用。響應曲面圖可以形象地看出各因素之間的相互作用及最佳參數[22]，圖5是各個因素交互作用的響應曲面圖。圖5B和5D的響應面坡度都比較陡峭，說明超聲功率(X1)與乙醇體積分數(X3)和液料比(X2)與乙醇體積分數(X3)的交互作用對山茱萸葉黃酮提取得率的影響較顯著；而圖5A、5C、5E和5F的響應面坡度都比較平緩，說明其他因素之間的交互作用對提取得率的影響不顯著。

2.2.4 驗證性實驗

通過軟件的進一步分析可以得到最大響應值(Y)時各因素(X1、X2、X3、X4)對應的值分別為：X1=290.82 W，X2=31.28∶1(mL/g)，X3=60.72%，X4=22.70 min。在此條件下，理論上山茱萸葉黃酮的提取得率為6.341 43%。

按照響應面確定的各因素的最優值，來驗證所得結果的可靠性。根據實際操作的可行性，將最優工藝條件修正為超聲功率290 W、液料比31∶1(mL/g)、乙醇體積分數61%、提取時間23 min。在修正的最優實驗條件下，進行多次重復實驗，測得山茱萸葉黃酮提取得率的平均值為6.31%，與理論值很接近，相對誤差僅為0.50%，說明該回歸模型準確度高。

2.3 山茱萸葉黃酮抑菌實驗結果

山茱萸葉黃酮抑菌實驗結果如表4所示，山茱萸葉黃酮對沙門氏菌具有較強的抑菌作用，抑菌圈直徑達到12.04 mm；對綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌有較弱的抑菌作用，抑菌圈直徑較小；對大腸桿菌、禽巴氏桿菌和枯草芽孢桿菌沒有抑菌作用。山茱萸葉黃酮對中華根霉也有較弱的抑菌作用，但抑菌圈直徑只有7.55 mm；對黑曲霉和釀酒酵母沒有抑菌作用。

有研究表明，山茱萸果肉總苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均有較好的抑菌效果，抑菌圈直徑分別為20.0 mm、17.3 mm和16.7 mm[10]。山茱萸葉黃酮的抑菌效果雖然沒有山茱萸果肉強，但對細菌和真菌均有一定的抑菌作用；其對沙門氏菌的抑菌效果較強，對綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌也有較弱的抑菌效果，對真菌中的中華根霉也有較弱的抑菌效果。山茱萸葉黃酮對細菌的抑菌效果較強，對真菌的抑菌效果較弱；而且其對革蘭氏陰性菌的抑菌效果強于革蘭氏陽性菌。

表4 山茱萸葉黃酮的抑菌效果

注：“-”表示沒有抑菌活性。

Note：“-”indicates no antimicrobial activity.

2.4 山茱萸葉黃酮抗氧化活性實驗結果

2.4.1 山茱萸葉黃酮對DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是以氮為中心的化學性質比較穩定的自由基，它比較難被清除，如果能夠被受試物清除，說明受試物有較強的自由基清除能力。由圖6可知，山茱萸葉黃酮對DPPH自由基的清除率隨著樣品濃度的升高而增強，1.2 mg/mL時山茱萸葉黃酮對DPPH自由基的清除率達到77.24%；在檢測的濃度范圍內，山茱萸葉黃酮對DPPH自由基的清除能力略低于陽性對照BHT。山茱萸葉黃酮清除DPPH自由基的IC50為0.699 mg/L，BHT清除DPPH自由基的IC50為0.269 mg/L。結果說明，山茱萸葉黃酮具有較強的清除DPPH自由基的能力，但比BHT稍弱。

圖6 山茱萸葉黃酮對DPPH自由基的清除能力

2.4.2 山茱萸葉黃酮對羥基自由基清除能力

羥基自由基能夠使蛋白質、核酸等生物大分子損傷嚴重，故受試物對羥基自由基的清除效果也是衡量其抗氧化能力的一個重要指標[23]。由圖7可知，山茱萸葉黃酮對羥基自由基的清除率隨著樣品濃度的增加而增強，1.2 mg/mL時山茱萸葉黃酮對羥基自由基的清除率達到83.54%；在檢測的質量濃度范圍內，山茱萸葉黃酮對羥基自由基的清除能力高于陽性對照BHT。山茱萸葉黃酮清除羥基自由基的IC50為0.631 mg/L，BHT清除羥基自由基的IC50為1.134 mg/L。結果說明，山茱萸葉黃酮具有明顯的清除羥基自由基的能力，強于BHT。

圖7 山茱萸葉黃酮對羥基自由基的清除能力

Seeram等[12]研究發現山茱萸3-O-β-吡喃型半乳糖苷-飛燕草苷元、3-O-β-吡喃型半乳糖苷-矢車菊苷元和3-O-β-吡喃型半乳糖苷-天竺葵苷元的抗氧化活性分別為70.2%、60.1%和40.3%。當山茱萸葉黃酮濃度為1.2 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率達到77.24%，對羥基自由基的清除率達到83.54%；山茱萸葉黃酮清除DPPH自由基和羥基自由基的IC50分別為0.699 mg/L和0.631 mg/L。結果表明，山茱萸葉黃酮具有較強的抗氧化活性。

3 結論

本研究通過響應面法對豫西山茱萸葉黃酮的提取工藝進行優化，并對其體外抑菌和抗氧化活性進行研究。通過中心組合試驗得出提取山茱萸葉黃酮的優化回歸數學模型的相關系數為0.951 9，說明該模型相關度很好，能夠準確預測山茱萸葉黃酮的提取得率。四個因素中超聲功率和提取時間對山茱萸葉黃酮提取得率的影響極顯著，液料比對提取得率的影響顯著，且四個因素對提取得率的影響順序為提取時間>超聲功率>液料比>乙醇體積分數。經優化后，提取山茱萸葉黃酮的最優方案為：超聲功率290 W、液料比31∶1(mL/g)、乙醇體積分數61%、提取時間23 min。在此條件下，山茱萸葉黃酮的提取得率為6.31%，與理論值基本一致。超聲輔助提取技術具有提取時間短、提取效率高等優點，廣泛應用于天然產物的提取。超聲波的機械效應和空化效應能夠使溶劑向細胞的滲透量增大，并破壞細胞壁，有利于細胞內有效成分的溶出。

抑菌實驗結果表明，山茱萸葉黃酮對沙門氏菌的抑菌效果較強，對綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌也有較弱的抑菌效果，對真菌中的中華根霉也有較弱的抑菌效果。

抗氧化活性實驗結果表明，山茱萸葉黃酮具有較強的抗氧化活性；當山茱萸葉黃酮濃度為1.2 mg/mL時其對DPPH自由基的清除率達到77.24%，對羥基自由基的清除率達到83.54%；山茱萸葉黃酮清除DPPH自由基和羥基自由基的IC50分別為0.699和0.631 mg/L。

本研究為山茱萸葉的進一步開發利用奠定了基礎，同時也為篩選天然抗菌、抗氧化活性物質提供了一定的理論基礎。