石韋提取物抗氧化及抑制亞硝化作用研究

莊遠杯，凌梅娣，詹佳虹，李榕娣，張 超，魏愛紅，張聲源*

1嘉應學院醫學院；2嘉應學院醫學院客家藥用生物資源研究所，梅州 514031

自由基的化學性質活潑，可攻擊細胞內DNA、蛋白質、脂質等多種生物分子，導致細胞膜、遺傳因子嚴重損傷，進而誘發癌變、糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病[1-2]。天然抗氧化劑廣泛存在于果蔬和藥用植物中，能夠保護機體免受自由基誘導的氧化應激損傷，相對于合成的抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)及叔丁基對苯二酚(TBHQ)，具有安全、低毒等特點。亞硝胺的前體物質，如亞硝酸鹽和胺類，廣泛存在于腌制食物中，兩者在胃液酸性條件下極易發生亞硝化反應轉化為強致癌物—亞硝胺，進而引起鼻咽癌、食道癌、胃癌等多種器官惡性腫瘤，甚至通過胎盤屏障使下一代致癌[3]。清除體內亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的合成是預防亞硝胺所致癌癥的一項有效途徑。現代藥理研究表明，許多天然成分如黃酮類[4]、酚類[5]等能起到清除體內亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的作用，從而達到預防癌癥的效果。從天然產物中挖掘安全低毒的抗氧化劑和抑制亞硝化劑已成為食品科學領域的研究熱點。

石韋(Pyrrosialingua(Thunb.)Farwell)為水龍骨科(Polypodiaceae)石韋屬(Pyrrosia)的多年生草本植物，又名石皮、金星草，主產廣東、浙江、湖北等地，始載于《神農本草經》，為《中國藥典》收載，具有利尿通淋，清肺止咳，涼血止血等功效，臨床用于治療熱淋，血淋，石淋，小便不通等[6]。現代研究表明，石韋含有黃酮類、多酚、總皂苷、多糖等藥用成分，其中黃酮類、多酚類成分含量較高，具有抗菌、抗腫瘤、調節免疫功能、降血壓、降血糖等藥理活性[7,8]。國內外學者研究顯示，同屬植物有柄石韋具有良好的抗氧化活性[9-11]。但對石韋抗氧化活性和抑制亞硝化活性及其與總酚、總黃酮含量相關性的研究未見報道。

本實驗以石韋為研究對象，系統溶劑萃取分離，測定各提取物的總酚、總黃酮含量，比較各溶劑提取物的抗氧化活性和抑制亞硝化活性，并分析成分含量與活性的相關性，為石韋抗氧化活性和抑制亞硝化活性成分的分離指導提供實驗基礎，為開發利用石韋作為防癌抗癌保健食品和天然抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藥材石韋(Pyrrosialingua(Thunb.)Farwell)于2016年4月采自廣東省梅州市陰那山自然保護區，經鑒定為水龍骨科(Polypodiaceae)石韋屬(Pyrrosia)多年生草本植物。

沒食子酸標準品(上海金穗生物科技有限公司；批號20160410)；福林酚試劑(上海金穗生物科技有限公司；批號2016108)；蘆丁標準品(成都昂賽斯生物科技有限公司；批號20160815)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH；美國Sigma公司；批號STBB0829V)；2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS；美國Sigma公司；批號K1517067)；維生素C(Vc；西隴科學有限公司；批號20161213)；硝酸鋁(天津市科密歐化學試劑有限公司；批號20150202)；過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、無水三氯化鐵、無水檸檬酸、對氨基苯磺酸、二甲胺、1-萘胺、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；試劑均為分析純。

UV-1800型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；WFT-203B三用紫外線分析儀(上海精科實業有限公司)；N-1100V型旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)；FA2004型電子分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；TG16-WS臺式高速離心機(長沙維爾康湘鷹離心機有限公司)；JP-100S型超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設備有限公司)；WJX-A1000型多功能搖擺粉碎機(上海緣沃工貿有限公司)；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 石韋醇提取物及不同溶劑提取物的制備

石韋2.0 kg，經50 ℃烘干，粉碎，用2倍量的95%乙醇超聲提取3次，合并提取液，減壓濃縮得浸膏(230 g)。取浸膏200 g分散于適量蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑得石油醚提取物(PL-P，25 g)，乙酸乙酯提取物(PL-E，66 g)，正丁醇提取物(PL-B，53 g)，水提取物(PL-W，50 g)，置于玻璃真空干燥器中保存備用。

1.2.2 總酚含量測定

Folin-酚法測定總酚含量[12]。精密稱取真空干燥至恒重的沒食子酸標準品20.0 mg，用蒸餾水溶解并定容于100 mL棕色量瓶中，得質量濃度為0.2 g/L沒食子酸標準溶液。分別精密移取沒食子酸標準溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于10 mL棕色具塞比色管中，依次加入6.0 mL蒸餾水，0.5 mL福林試劑，充分搖勻，室溫避光靜置2 min，再加入2.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，蒸餾水至刻度，混勻后常溫避光反應90 min，于波長760 nm處測定吸光度。各提取物的總酚含量參考沒食子酸(gallic acid，GA)標準曲線用沒食子酸當量(每克干樣品中酚類化合物相當于沒食子酸的毫克數，mg/g)表示。每個提取物平行測定3次。

1.2.3 總黃酮含量測定

硝酸鋁法測定總黃酮含量[13]。精密稱取蘆丁標準品20.0 mg，用60%乙醇溶解并定容至100 mL棕色量瓶中，得質量濃度為0.2 g/L蘆丁標準溶液。分別精密移取蘆丁標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL棕色具塞比色管中，依次加入蒸餾水至7.0 mL，5 %亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，靜置4 min，加入10% Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻，靜置4 min，加入4 %氫氧化鈉試液10.0 mL，再加蒸餾水至刻度，搖勻，放置10 min，于波長500 nm處測定吸光度。各提取物的總黃酮含量參考蘆丁(rutin,RT)標準曲線用蘆丁當量(每克干樣品中黃酮類化合物相當于蘆丁的毫克數，mg/g)表示。每個提取物平行測定3次。

1.2.4 抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH法

DPPH自由基清除能力的測定參考文獻[14]，稍作改進。分別精密移取1.0 mL不同質量濃度的樣品和Vc溶液于10 mL試管中，分別加入0.1 mmoL/L DPPH甲醇溶液1.0 mL，室溫避光靜置20 min，以甲醇作為空白對照，于波長517 nm處測定吸光度(Ai)；同時測定1.0 mL DPPH甲醇溶液與1.0 mL甲醇溶液混合后在波長517 nm處的吸光度(A0)；測定1.0 mL甲醇溶液與1.0 mL樣品溶液在波長517 nm處的吸光度(Aj)；每個樣品平行測定3次。根據公式(1)計算出石韋不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率=

[1-(Ai-Aj)/A0]× 100%

(1)

1.2.4.2 ABTS法

ABTS自由基清除能力測定參考文獻[15]，稍作改進。將7.0 mmoL/L的ABTS溶液與2.45 mmoL/L過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫避光靜置12～16 h，制備ABTS自由基母液。用10 mmoL/L(pH7.4)磷酸緩沖溶液將ABTS自由基母液稀釋，使其在波長734 nm處吸光度達到0.70±0.02。分別將0.1 mL不同質量濃度樣品溶液和Vc溶液加入4.0 mL ABTS自由基溶液中，振蕩30 s后室溫靜置10 min，于波長734 nm處測量吸光度(Ai)；同時測定4.0 mL ABTS自由基溶液與0.1 mL甲醇溶液混合后在波長734 nm處的吸光度(A0)；測定4.0 mL(10 mmoL/L；pH 7.4)磷酸緩沖溶液與1.0 mL樣品溶液在波長734 nm處的吸光度(Aj)；每個樣品平行測定3次。根據公式(2)計算出石韋不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除率。

ABTS自由基清除率=

[1-(Ai-Aj)/A0]× 100%

(2)

1.2.4.3 普魯士藍法

鐵還原力的測定參考文獻[16]。分別精密移取2.0 mL 不同質量濃度的樣品和Vc溶液于10 mL試管中，再分別加入2.0 mL 磷酸緩沖溶液(2.0 mol/L，pH6.6)和2.0 mL 1%鐵氰化鉀，搖勻，于50 ℃恒溫水浴20 min后取出急速冷卻，再分別加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液。將上述溶液離心10 min(6 000 rpm)，取上清液2.0 mL，加入1.5 mL蒸餾水及0.5 mL 0.1% FeCl3溶液混勻，靜置10 min后于700 nm測定吸光度，每個樣品平行測定 3 次，鐵還原力大小用每克樣品的Vc當量表示(μmoL/g)。

1.2.5抑制亞硝化活性研究

1.2.5.1 鹽酸萘乙二胺法

亞硝酸鹽清除率的測定參考文獻[17]。pH3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液2.0 mL，分別加入不同質量濃度的樣品和Vc溶液1.0 mL，5 μg/mL的亞硝酸鈉溶液2.0 mL于25 mL比色管中，在37℃水浴1 h，取出，立即加入0.4%對氨基苯磺酸2.0 mL，混勻，靜置3～5 min，各加1.0 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液。加蒸餾水至刻度，混勻，靜置15 min，在538 nm下測定吸光度，每個樣品平行測定 3 次。根據公式(3)計算出石韋不同溶劑提取物對亞硝酸鹽的清除率。

亞硝酸鹽清除率=

[1-(Ai-Aj)/A0]× 100%

(3)

式中：A0為空白對照組的吸光度值(蒸餾水代替樣品溶液)；Ai為樣品組的吸光度值；Aj為未加亞硝酸鈉溶液的吸光度值(蒸餾水代替亞硝酸鈉溶液)，下同。

1.2.5.2α-萘胺法

亞硝胺合成阻斷率的測定參考文獻[18]。分別移取不同質量濃度的樣品和Vc溶液5.0 mL于25 mL比色管中，加入pH3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液10.0 mL、1 mmoL/L NaNO2溶液1.0 mL、1 mol/L的二甲胺溶液1.0 mL，加入蒸餾水至25.0 mL，在37 ℃下恒溫1 h。吸取1.0 mL上述溶液至25 mL小燒杯中，加入質量分數0.5% Na2CO3溶液0.5 mL，于紫外分析儀上(254 nm)照15 min。取出后加入質量分數1%對氨基苯磺酸1.5 mL，再加入質量分數0.1%α-萘胺1.5 mL、蒸餾水0.5 mL，搖勻，靜置15 min，在最大吸收波長525 nm處測定吸光度，每個樣品平行測定3次。根據公式(4)計算出石韋不同溶劑提取物對亞硝胺合成的阻斷率。

亞硝胺合成的阻斷率=

[1-(Ai-Aj)/A0]× 100%

(4)

1.3 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 石韋各提取物總酚和總黃酮含量

沒食子酸標準曲線如圖1所示，線性擬合方程Y=0.104 6X+ 0.032 2，R2=0.997，線性關系良好。

圖1 沒食子酸標準曲線

蘆丁標準標準曲線如圖2所示，線性擬合方程Y=0.013 3X-0.007 2，R2=0.997，線性關系良好。

圖2 蘆丁標準曲線

石韋4個不同溶劑提取物總酚和總黃酮含量如表1所示。結果顯示，總酚和總黃酮在不同溶劑提取物中的含量差異顯著(P<0.05)，且總酚和總黃酮含量大小均為PL-B>PL-W>PL-E>PL-P。其PL-B中的總酚、總黃酮含量最高，分別為29.85±2.15和37.23±2.41 mg/g，明顯大于其余3個提取物。表明正丁醇可高度富集石韋醇提取物中的酚類和黃酮類成分，對PL-B的進一步分離純化以研究石韋酚類和黃酮類成分具有重要的指導意義。

表1 石韋不同溶劑提取物的總酚和總黃酮含量

注：同行肩標字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different data in the same row means significant difference(P<0.05),the same below.

2.2 體外抗氧化活性測定結果

2.2.1 DPPH 自由基清除能力

石韋不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除率測定結果見圖3、表2。由圖3可知，在40～200 μg/mL的質量濃度范圍內，石韋各溶劑提取物對DPPH自由基均具有一定程度的清除作用，清除率隨質量濃度的增大而增大，呈一定的量效關系。在相同質量濃度下，PL-B對DPPH自由基的清除率最高，最高可達90.76%。

由表2可知，石韋各溶劑提取物清除DPPH自由基能力大小依次為PL-B>PL-W>PL-E>PL-P，其中PL-B和PL-W清除DPPH 自由基的IC50值較為接近，且顯著小于PL-E和PL-P，表明石韋清除DPPH自由基的活性物質主要集中在較大極性的水提取物和正丁醇提取物。

圖3 石韋各溶劑提取物對DPPH自由基清除能力的影響

表2 石韋各溶劑提取物清除DPPH自由基的IC50值

2.2.2 ABTS自由基清除能力

石韋不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除率測定結果見圖4、表3。由圖4可知，石韋各溶劑提取物清除ABTS自由基能力隨質量濃度的增大而增強。當質量濃度為200 μg/mL時，清除率由高到低依次為：PL-B>PL-W>PL-E>PL-P，其中PL-B的清除率高達90.08%，接近于陽性對照Vc(95.67%)。

由表3可知，石韋各溶劑提取物清除ABTS自由基能力具有顯著性差異(P<0.05)，清除能力大小依次為PL-B>PL-W>PL-E>PL-P。其中PL-B清除ABTS自由基的IC50值為97.47±12.10 μg/mL，遠遠小于其它3個溶劑提取物，表明石韋對ABTS自由基清除的活性物質可有效富集在正丁醇提取物。

圖4 石韋各溶劑提取物對ABTS自由基清除能力的影響

表3 石韋各溶劑提取物清除ABTS自由基的IC50值

2.2.3 鐵還原能力的測定

石韋不同溶劑提取物對鐵還原能力的測定結果見圖 5。由圖5可知，石韋PL-B的鐵還原能力最強(822.08±24.82 μmoL Vc/g)，單因素方差分析和多重比較(Duncan法)結果顯示，PL-B的鐵還原能力與其它溶劑提取物存在顯著性差異(P<0.05)，表明石韋對鐵還原能力的活性物質主要集中在正丁醇提取物。

2.3 體外抑制亞硝化活性測定結果

2.3.1 亞硝酸鹽的清除能力

石韋不同溶劑提取物對亞硝酸鹽的清除率測定結果見圖6、表4。由圖6可知，在模擬胃酸條件下，石韋各溶劑提取物具有一定的清除亞硝酸鹽的能力，隨質量濃度增大而增強。

圖5 石韋各溶劑提取物對鐵還原能力的影響

由表4可知，石韋各溶劑提取物清除亞硝酸鹽能力大小依次為PL-B>PL-W>PL-E>PL-P。其中PL-B清除亞硝酸鹽的 IC50值為7.071±0.231 mg/mL，明顯小于其余三個溶劑提取物，表明石韋對亞硝酸鹽清除的活性物質主要集中在正丁醇提取物。

圖6 石韋各溶劑提取物對亞硝酸鹽清除能力的影響

表4 石韋各溶劑提取物清除亞硝酸鹽的IC50值

2.3.2 亞硝胺合成的阻斷能力

石韋不同溶劑提取物對亞硝胺合成的阻斷力測定結果見圖7、表5。由圖7可知，石韋各溶劑提取物具有一定的阻斷亞硝胺合成的能力，隨質量濃度增大而增強，呈一定的量效關系。其中，PL-B對亞硝胺合成的阻斷能力最強，在質量濃度為20.0 mg/mL時，阻斷率達65.03%。

由表5可知，石韋各溶劑提取物阻斷亞硝胺合成能力大小依次為PL-B>PL-W>PL-E>PL-P。其中PL-B阻斷亞硝胺合成的IC50值為15.010±1.224 mg/mL，明顯小于其余三個溶劑提取物，表明石韋阻斷亞硝胺合成的活性物質主要集中在正丁醇提取物。

圖7 石韋各溶劑提取物對亞硝胺合成阻斷能力的影響

表5 石韋各溶劑提取物阻斷亞硝胺合成的IC50值

2.4 總酚和總黃酮含量與抗氧化活性和抑制亞硝化活性的相關性分析

石韋不同溶劑提取物總酚、總黃酮含量與抗氧化活性和抑制亞硝化活性的相關性結果見表 6。

由表6可知，石韋各溶劑提取物總酚、總黃酮含量與ABTS自由基清除能力、亞硝胺合成的阻斷能力呈極顯著正相關(P<0.01)，與DPPH自由基清除能力、鐵還原能力、亞硝酸鹽清除能力呈顯著正相關(P<0.05)。表明石韋各溶劑提取物總酚、總黃酮含量與抗氧化活性和抑制亞硝化活性具有顯著相關性，其中總酚、總黃酮含量對ABTS自由基清除能力及亞硝胺合成的阻斷能力的影響大于DPPH 自由基清除能力、鐵還原能力、亞硝酸鹽清除能力。

表6 相關性分析結果

注：**雙側極顯著相關(P<0.01)，*雙側顯著相關(P<0.05)。

Note:**indicates significant correlation at 0.01 level(both sides);*indicates significant correlation at 0.05 level(bilateral).

3 結論與討論

石韋為常用中藥，臨床用于膀胱炎、泌尿系結石、尿血的治療[7]，療效確切，其資源分布較廣，有良好的開發前景，但其發揮活性作用的物質基礎尚不明確。

實驗以藥材石韋為原料，對其總酚、總黃酮含量及其抗氧化和抑制亞硝化活性進行了系統研究。試驗結果表明，各提取物均含有總酚、總黃酮，其中正丁醇提取物(PL-B)中總酚、總黃酮的含量較高，并顯著高于其他提取物，差異具有統計學意義(P<0.05)。活性研究顯示，各提取物均有不同程度的還原力、自由基清除作用以及抑制亞硝化作用，并呈一定的量效關系。從整體上看，正丁醇提取物(PL-B)表現出較強的DPPH、ABTS 自由基清除作用和較強的Fe3+還原作用，且明顯強于其他提取物(P<0.05)。與此同時，正丁醇提取物(PL-B)對亞硝化反應有較好的抑制作用，能夠清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的合成，并優于其他提取物，差異具有統計學意義(P<0.05)。以上實驗結果提示，石韋抗氧化和抑制亞硝化活性成分主要存在于極性較大的正丁醇提取物中，這可能與其富含黃酮類、酚酸類活性成分有關[19]，學者Mizuno等[20]也從石韋正丁醇提取物中分離得到了綠原酸，且含量豐富，現已為藥典規定的石韋指標性成分。相關性分析顯示，總酚、總黃酮含量對ABTS自由基清除能力及亞硝胺合成阻斷能力呈極顯著正相關(P<0.01)，對DPPH 自由基清除能力、鐵還原能力、亞硝酸鹽清除能力呈顯著正相關(P<0.05)。因此，石韋提取物中，石韋正丁醇提取物具有較強的體外抗氧化和抑制亞硝化活性，總酚、總黃酮是其發揮作用的物質基礎。石韋正丁醇提取物可用于天然抗氧化劑開發，同時極有可能是一種新的防癌抗癌天然保健品。提示應以ABTS自由基清除和亞硝胺合成阻斷能力為活性指標對石韋正丁醇提取物中的總酚和總黃酮進一步分離純化，明確活性物質基礎，并對抗氧化和抑制亞硝化活性成分的構效關系、作用機制、以及活性成分間的協同或拮抗作用等方面開展系統性研究，將有助于闡明石韋藥用科學內涵，為開發石韋作為防癌抗癌保健食品和天然抗氧化劑提供參考。