聚肽HVLPs 的制備與載藥性能

王紅權(quán)， 續(xù)文恒， 張 朔， 姜翔宇， 李 慧， 陳家琛， 蔡春華， 林嘉平

（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海市先進聚合物材料重點實驗室，上海 200237）

自然界中的病毒以DNA 或RNA 為核，蛋白質(zhì)在外層有序排列形成衣殼。病毒的衣殼蛋白質(zhì)通常形成規(guī)整有序的表面納米結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)使病毒表現(xiàn)出高效的細胞內(nèi)化能力[1]。模仿病毒的結(jié)構(gòu)特征，人們通過聚合物自組裝構(gòu)建了一系列仿病毒粒子（VLPs），這些VLPs 在藥物載體、基因工程等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[2,3]。聚肽由氨基酸構(gòu)成，具有良好的生物相容性；聚肽共聚物可以自組裝形成形貌豐富的結(jié)構(gòu)，在構(gòu)筑VLPs 方面具有獨特的優(yōu)勢[4-6]。近期，本課題組[7-10]研究表明，聚（γ-芐基L-谷氨酸酯）-b-聚乙二醇（PBLG-b-PEG）嵌段共聚物與PBLG 均聚物或聚苯乙烯（PS）均聚物共混自組裝，可以形成棒狀或球狀VLPs：均聚物形成棒狀或球狀內(nèi)核，嵌段共聚物構(gòu)成外殼，并有序排列形成規(guī)整的表面納米結(jié)構(gòu)。這些聚集體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與天然病毒相似，可以作為仿病毒材料開展性能研究。

中空納米粒子具有高負載特性，在藥物釋控、催化等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用與研究價值[11-13]。模板法是制備中空納米粒子的常用方法[14,15]。制備過程常以交聯(lián)或者聚合的方式固定殼結(jié)構(gòu)，經(jīng)溶劑溶解除去模板后得到中空納米粒子，這種方法簡單高效、納米粒子的結(jié)構(gòu)可調(diào)控性強[16]。目前，已報道的利用模板法制備的中空納米粒子通常缺乏規(guī)整的表面納米結(jié)構(gòu)。

本文基于聚肽共聚物自組裝，制備了一種具有規(guī)整表面納米結(jié)構(gòu)的中空仿病毒粒子（HVLPs），并研究了其載藥性能。利用聚（γ-芐基L-谷氨酸酯-co-肉桂基L-谷氨酸酯）-b-聚乙二醇（P（BLG/CLG）-b-PEG）嵌段共聚物與PBLG 均聚物或PS 均聚物共混自組裝，形成具有核-殼結(jié)構(gòu)的棒狀或球狀VLPs（其中均聚物構(gòu)成內(nèi)核，嵌段共聚物構(gòu)成外殼并形成有序納米結(jié)構(gòu)）；通過紫外光照射交聯(lián)VLPs 殼層中肉桂酰氧基上的碳碳雙鍵固定殼層納米結(jié)構(gòu)，并用N,N′-二甲基甲酰胺（DMF）溶解球狀VLPs 的PS 均聚物內(nèi)核，制備出表面具有條紋的球狀HVLPs。以阿霉素（DOX）為模型藥物，研究了球狀HVLPs 對DOX 的負載和釋放性能。本研究為制備具有規(guī)整表面納米結(jié)構(gòu)的HVLPs 提供了新策略，所制備的表面帶有條紋的HVLPs 有望在藥物載體等領(lǐng)域得到應(yīng)用。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

PBLG-b-PEG 嵌段共聚物：PBLG 鏈段Mn= 3.0×104，聚合度為137，PEG 鏈段Mn= 5.0×103，聚合度為113，Mw/Mn= 1.12，自制[17]；PBLG 均聚物：Mn= 1.7×105，Mw/Mn= 1.23，自制[18]；PS 均聚物，Mn= 7.2×103，Mw/Mn=1.04，自制[7]；四氫呋喃（THF）、 DMF、碳酸氫鈉、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、肉桂醇（CA）、二甲基亞砜（DMSO）：上海泰坦科技有限公司，直接使用；二氯乙酸（DCA）：w=99%，Sigma-Aldrich 上海貿(mào)易有限公司；氫溴酸的醋酸溶液：w=33%，上海百靈威技術(shù)有限公司；實驗用超純水：電阻率為18.2 MΩ·cm，Millipore 超純水系統(tǒng)制備；透析袋：截留分子量為3 500，Serva Electrophoresis GmbH 公司。

核磁共振氫譜（1H-NMR）：美國布魯克公司 Avance 400 型核磁共振儀，CDCl3-CF3COOD（體積比為5/1）為溶劑，TMS 為內(nèi)標(biāo)物；紅外吸收光譜（FT-IR）：美國熱電Nicolet 5700 型傅里葉變換紅外光譜儀，采用涂膜制樣，測試范圍是4 000～400 cm?1；紫外-可見光光譜（UV-Vis）：美國瓦里安公司Lambda 950 型紫外-可見光分光光度計；掃描電子顯微鏡（SEM）：日本日立公司（Hitachi）S-4800 型場發(fā)射掃描電鏡，加速電壓為10 kV，將樣品溶液滴于硅片上，自然風(fēng)干，測試前噴鉑處理；透射電子顯微鏡（TEM）：日本電子公司（JEOL）JEM-1400 型透射電子顯微鏡，加速電壓100 kV，將樣品滴于銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干。

1.2 P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物的合成

1.2.1 P（BLG/LGA）-b-PEG 嵌段共聚物的制備 將0.3 g PBLG-b-PEG 嵌段共聚物置于100 mL 的單口燒瓶中，加入10 mL 二氯乙酸，室溫下磁力攪拌2 h。然后，取0.3 mL 氫溴酸的醋酸溶液加入到單口燒瓶中，磁力攪拌20 min 后，加入飽和的碳酸氫鈉溶液，將反應(yīng)液調(diào)至弱酸性。經(jīng)透析、冷凍干燥后得到白色固體粉末P（BLG/LGA）-b-PEG。

1.2.2 P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物的制備 取0.15 g P（BLG/LGA）-b-PEG 嵌段共聚物于干燥潔凈的茄型反應(yīng)瓶中，以5 mL 無水DMSO 溶解。加入2 mL EDC·HCl（0.055 g/mL）和2 mL DMAP（0.025 g/mL）的DMSO溶液，磁力攪拌30 min 后，加入2 mL CA 的DMSO 溶液（0.08 g/mL）。室溫下反應(yīng)3 d 后，經(jīng)乙醇、純水透析并冷凍干燥得到白色粉末狀固體P（BLG/CLG）-b-PEG，反應(yīng)流程如圖1 所示。

圖 1 可光交聯(lián)的P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物的合成路線Fig. 1 Synthetic route of photo-crosslinkable P（BLG/CLG）-b-PEG block copolymer

1.3 仿病毒組裝體的制備

1.3.1 毛線球狀仿病毒組裝體的制備 將P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物和PS 均聚物分別以THF-DMF 混合溶劑（體積比為1/1）溶解，質(zhì)量濃度均為0.5 g/L。取P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物溶液2 mL 與PS 均聚物溶液2 mL 混合，振蕩過夜。在磁力攪拌下，以0.12 mL/min 的速率滴加1.2 mL 超純水，通過純水透析3 d，得到約6.4 mL“毛線球”狀組裝體水溶液。

1.3.2 螺旋棒狀仿病毒組裝體的制備 將P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物和PBLG 均聚物分別以THF-DMF混合溶劑（體積比為3/7）溶解，質(zhì)量濃度均為0.2 g/L。取P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物溶液2.4 mL與PBLG 均聚物溶液1.6 mL 混合，振蕩過夜。在磁力攪拌下，以0.12 mL/min 的速率滴加1.2 mL 超純水，通過純水透析3 d，得到約6.8 mL“螺旋棒”狀組裝體水溶液。

1.4 HVLPs 的制備與性能

1.4.1 HVLPs 的制備 將得到的“毛線球”狀組裝體水溶液（約6.4 mL）濃縮至2 mL，并加入石英試管中，置于波長λ = 254 nm 的紫外光下照射1 h（試管與紫外燈源之間的距離約15 cm），交聯(lián)球狀VLPs 的殼結(jié)構(gòu)。取1 mL 組裝體水溶液加到8 mL DMF 中，室溫下攪拌15 min，以除去組裝體內(nèi)部的均聚物內(nèi)核，得到9 mL 球狀HVLPs 母液。

“螺旋棒”狀組裝體水溶液制備HVLPs 過程與上述操作類似。

1.4.2 載藥HVLPs 的制備 向7 個樣品瓶中各加入0.9 mL 球狀HVLPs 母液（經(jīng)計算HVLPs 的質(zhì)量約50 μg），再依次加入質(zhì)量濃度為0.2 g/L 的DOX 的DMF 溶液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL 和1.2 mL。分別再補加適量DMF 至各個樣品瓶中，使溶液的總體積為2.1 mL，室溫下攪拌4 h，然后以0.04 mL/min 的速率向各個樣品瓶中滴加0.4 mL 純水，制備負載DOX 的VLPs。此時，溶液中含有2 mL DMF 和0.5 mL 水。

將負載DOX 的VLPs 溶液以孔徑為0.20 μm 的聚四氟乙烯濾膜過濾，除去VLPs，得到各個樣品的濾液。通過紫外分光光度計測定吸光度，得到各濾液中游離的DOX 質(zhì)量，計算出負載到VLPs 中的DOX 質(zhì)量。

1.4.3 載藥HVLPs 的藥物釋放行為 取0.9 mL 球狀HVLPs 母液加入到棕色樣品瓶中，加入質(zhì)量濃度為0.2 g/L的DOX 的DMF 溶液1.2 mL。室溫下攪拌4 h，然后以0.04 mL/min 的速率滴加0.4 mL 超純水，得到負載DOX的VLPs。將負載DOX 的VLPs 溶液裝入透析袋中，用超純水透析3 d，得到負載DOX 的VLPs 水溶液。

將負載DOX 的VLPs 水溶液轉(zhuǎn)移至裝有40 mL 磷酸鹽（PBS）緩沖溶液（pH = 7.4）的燒杯中，37 ℃下振蕩，振蕩頻率100 r/min。定時取5 mL 樣品，并補充5 mL PBS 緩沖液。以紫外分光光度計測定樣品溶液在485 nm 的吸光度，根據(jù)DOX 在PBS 緩沖液（pH = 7.4）中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出相對應(yīng)的藥物累計釋放量。

1.5 測試與表征

1.5.1 P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物的交聯(lián)性能測定 將P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物以THF-DMF 混合溶劑（體積比為3/7）溶解，質(zhì)量濃度為0.2 g/L。取該溶液20 mL，以0.6 mL/min 的速率滴加6 mL 的超純水，經(jīng)透析后得到P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物的聚集體水溶液。

將P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物的聚集體水溶液置于波長λ= 254 nm 的紫外光下照射，每隔一段時間取樣，用紫外分光光度計測定樣品在200～400 nm 的吸收光譜，表征其交聯(lián)反應(yīng)程度。

1.5.2 HVLPs 的載藥性能測定 （1）DOX 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：以DMF-H2O（體積比4/1）為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度（ρ）為25、50、75、100、125 μg/mL 的DOX 溶液，使用紫外分光光度計測定各個溶液在485 nm 處的吸光度（A），經(jīng)擬合得到DOX 吸光度和質(zhì)量濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線：ρ= 53.713 06 A，R2= 0.999 3。以PBS 為溶劑，得到DOX 在pH = 7.4 的PBS 緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線：ρ= 64.614 19 A，R2= 0.999 9。（2）VLPs 相對載藥量和包封率的計算：用紫外分光光度計測定各個濾液在485 nm 處的吸光度，得到游離的DOX 質(zhì)量，以DOX 投入量與游離量的差值，推出載入VLPs 的DOX 質(zhì)量。通過公式（1）計算出負載于HVLPs 的DOX 質(zhì)量（ms），根據(jù)公式（2）計算VLPs 的相對載藥量（D），根據(jù)公式（3）計算藥物的包封率（N）：

其中：A0為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出DOX 對應(yīng)質(zhì)量濃度的吸光度；As為各個濾液的吸光度； m0為初始投入的DOX質(zhì)量；ms為載入HVLPs 中的DOX 質(zhì)量；mp為球狀VLPs 的質(zhì)量（50 μg）。

1.5.3 HVLPs 藥物釋放性能測定 根據(jù)不同時間DOX 的累計釋放量（mt）與載入HVLPs 中的DOX 質(zhì)量的比值 計算得到藥物釋放百分比（R）：

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物表征

圖2 為PBLG-b-PEG 和P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物的1H-NMR 譜圖。P（BLG/CLG）-b-PEG 的譜圖中在化學(xué)位移6.70、6.31 處出現(xiàn)了新吸收峰，這兩處吸收峰分別對應(yīng)于肉桂酰氧基上―CH=CH―的質(zhì)子。此結(jié)果表明肉桂醇成功接枝到共聚物上。根據(jù)P（BLG/CLG）-b-PEG 譜圖中化學(xué)位移5.05 與2.42 處的峰面積比值計算出脫芐基率為10.0%；再根據(jù)化學(xué)位移6.70、6.31 與2.42 處的峰面積比值，計算出肉桂酰氧基的接枝率為10.0%，表明酯化完全。

2.2 P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物的交聯(lián)性能研究

圖 2 樣品的1H-NMR 譜圖Fig. 2 1H-NMR spectra of samples

經(jīng)波長254 nm 的紫外光照射后，肉桂酰氧基上的C=C 雙鍵之間發(fā)生[2 + 2]環(huán)加成反應(yīng)[19-21]，實現(xiàn)了聚肽鏈與鏈之間交聯(lián)（圖3（a））。P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物的紫外吸收光譜如圖3（b）所示，由圖可見，隨著紫外光照射時間延長，284 nm 和293 nm 處歸屬于肉桂酰氧基上C=C 的特征吸收峰逐漸降低，說明C=C雙鍵相互之間不斷發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，使體系中的C=C 雙鍵不斷減少。

圖 3 P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物[2+2]環(huán)加成反應(yīng)示意圖（a）；P（BLG/CLG）-b-PEG 聚集體的紫外光照射時間-紫外吸收光譜圖（b）；At /A0 與紫外光照射時間的關(guān)系圖（c）；P（BLG/CLG）-b-PEG 紫外光照射前后的紅外光譜圖（d）與1H-NMR 譜圖（e）（紫外光照射40 min）Fig. 3 Schematic illustration of [2 + 2] cycloaddition reaction of P（BLG/CLG）-b-PEG copolymer（a）; UV-Vis spectra of aqueous solution of P（BLG/CLG）-b-PEG aggregates subjected to UV-irradiation at 254 nm as a function of irradiation time（b）; Plot of At /A0 against irradiation time（c）; FT-IR（d） and 1H-NMR（e） spectra of P（BLG/CLG）-b-PEG before and after UV-irradiation for 40 min

圖3（c）中， A0為未經(jīng)紫外光照射，紫外吸收光譜中293 nm 處的吸光度；At為t 時刻紫外吸收光譜中293 nm處的吸光度。P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物環(huán)加成反應(yīng)過程中，在0～40 min，A /A 迅速降低，表明環(huán)加成反應(yīng)迅速進行；當(dāng)紫外光照射時間超過60 min 后，At/A0就趨于穩(wěn)定，表明C=C 雙鍵已經(jīng)基本反應(yīng)完全。

C=C 雙鍵的交聯(lián)反應(yīng)也由紅外光譜得到證實，如圖3（d）所示。965 cm?1處為肉桂酰氧基上的=C―H 的彎曲振動峰，1 650 cm?1處為C=C 的伸縮振動峰。交聯(lián)后，965 cm?1處肉桂酰氧基上=C―H 的彎曲振動吸收峰消失，這是由于紫外光照射后，PBLG 嵌段側(cè)基上C=C 的環(huán)加成反應(yīng)使肉桂酰氧基上的=C―H 消失導(dǎo)致；而1 650 cm?1處的峰稍有減弱，是由于1 650 cm?1處肉桂酰氧基上C=C 的伸縮振動峰與PBLG 鏈段的α-螺旋構(gòu)象峰重疊[22]。

圖3（e）為紫外光照射交聯(lián)前后的P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物1H-NMR 譜圖。由圖可見，交聯(lián)后，6.70、6.31 處肉桂酰氧基上的―CH=CH―質(zhì)子吸收峰均消失，這也進一步證實了PBLG 嵌段側(cè)基上的C=C雙鍵發(fā)生了環(huán)加成反應(yīng)。此外，由于環(huán)加成反應(yīng)導(dǎo)致高分子鏈間發(fā)生交聯(lián)，使交聯(lián)的共聚物在氘代試劑中的溶解性變差，導(dǎo)致側(cè)鏈上位于2.42、2.10、1.91 處的質(zhì)子吸收峰以及主鏈上4.60 處的質(zhì)子吸收峰出峰變得不明顯。

2.3 HVLPs 的形貌表征與分析

P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物與PS 均聚物共混自組裝得到表面具有條紋的球狀VLPs（圖4（a）），經(jīng)254 nm 的紫外光照射后，得到殼結(jié)構(gòu)固定的球狀VLPs（圖4（b））。將球狀VLPs 水溶液加到DMF 中浸泡15 min 后，得到了球狀HVLPs（圖4（c））。從SEM 圖可以看出，聚集體結(jié)構(gòu)呈塌縮態(tài)且表面為褶皺狀，表明球狀VLPs 的PS 均聚物內(nèi)核已被去除。TEM 觀察也證實了其中空結(jié)構(gòu)，如圖4（d）所示，在TEM 圖中聚集體呈縱橫交錯的明暗條紋狀態(tài)，襯度差異明顯。這是由于球狀HVLPs 殼結(jié)構(gòu)中的條紋結(jié)構(gòu)相互疊加導(dǎo)致。

圖 4 SEM 表征P（BLG/CLG）-b-PEG/均聚物共混自組裝形成的聚集體形貌：交聯(lián)前（a）后（b）球狀VLPs；球狀HVLPs 的SEM圖（c）和TEM 圖（d）；交聯(lián)前（e）后（f）棒狀VLPsFig. 4 SEM images of aggregates formed by P（BLG/CLG）-b-PEG/homopolymer mixtures: Spherical VLPs before（a） and after（b） UVirradiation; Typical SEM（c） and TEM（d） images of spherical HVLPs; Rod-like VLPs before（e） and after（f） UV-irradiation

P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物與PBLG 均聚物共混自組裝得到螺旋棒狀VLPs（圖4（e）），經(jīng)紫外光照射后，得到殼結(jié)構(gòu)固定的棒狀VLPs（圖4（f））。按照球狀VLPs 的制備流程，將棒狀VLPs 的聚集體水溶液加到大量DMF 中，觀察到DMF 不能溶解棒狀VLPs 的PBLG 內(nèi)核，無法制備出棒狀HVLPs。分析原因如下：（1）相較于“毛線球”聚集體的內(nèi)核PS 均聚物，螺旋棒的內(nèi)核PBLG 均聚物分子鏈為剛性鏈，運動能力較差；（2）構(gòu)成“毛線球”聚集體內(nèi)核的PS 均聚物分子量較小，經(jīng)DMF 溶解后，易穿過交聯(lián)的殼結(jié)構(gòu)，而構(gòu)成螺旋棒內(nèi)核的PBLG 均聚物分子量較大，穿過殼結(jié)構(gòu)較難。

2.4 HVLPs 載藥性能研究

以DOX 為模型藥物，研究了球狀HVLPs 的載藥性能。向球狀HVLPs 和DOX 的混合溶液中加水后，疏水藥物DOX 載入到HVLPs 內(nèi)。DOX 在DMF-H2O（體積比為4/1）溶劑中的最大吸收波長為485 nm（圖5（a））；在此條件下，DOX 吸光度和質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5（b）所示。

利用擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算了VLPs 的相對載藥量和包封率與相對投藥量之間的關(guān)系。相對投藥量以DOX 的質(zhì)量與DOX 和球狀HVLPs 總質(zhì)量的比值（fDOX）來表示。本文中，根據(jù)DOX 與VLPs 的質(zhì)量，fDOX為0.09～0.83。如圖5（c）所示，隨著fDOX的增大，VLPs 的相對載藥量也會明顯增大，而包封率會降低；當(dāng)fDOX=0.83 時，VLPs 的相對載藥量達到230%，包封率達到48%。

在fDOX= 0.83 條件下制備得到的載藥VLPs 的藥物釋放性能如圖5（d）所示。載藥VLPs 對DOX 具有較好的緩釋效果，在37 ℃，pH = 7.4 條件下，0～12 h 內(nèi)VLPs 的藥物釋放速率較快；而在12 h 以后，VLPs 的藥物釋放速率逐漸降低，72 h 的累計藥物釋放量達到80%。

圖 5 DOX 在DMF-H2O（體積比為4/1）溶劑中的紫外吸收光譜（a）；DOX 在DMF-H2O（體積比為4/1）溶劑中吸光度和質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線（485 nm）（b）；VLPs 的相對載藥量和包封率與投藥量的關(guān)系曲線（c）；在fDOX = 0.83 條件下制得的載藥VLPs的藥物緩釋曲線（d）Fig. 5 UV-Vis spectrum of DOX in DMF-H2O（Volume ratio 4/1）（a）; Mass concentration-absorbance profile of DOX in DMF-H2O（Volume ratio 4/1）（485 nm）（b）; Plots of drug-loading content and encapsulation percentage of DOX-loaded VLPs as a function of fDOX（c）;Drug release of DOX from drug-loaded VLPs prepared with fDOX = 0.83（d）

3 結(jié) 論

（1）制備出了可光交聯(lián)的P（BLG/CLG）-b-PEG 嵌段共聚物，以P（BLG/CLG）-b-PEG 分別與PBLG、PS 共混自組裝，制備出具有表面納米結(jié)構(gòu)的核-殼型棒狀和球狀VLPs。

（2）通過有機溶劑溶解可以除去球狀VLPs 的PS 均聚物內(nèi)核，得到球狀HVLPs；有機溶劑不能溶解除去棒狀VLPs 的PBLG 均聚物內(nèi)核。

（3）球狀HVLPs 對DOX 具有良好的負載能力，相對載藥量可以達到230%；載藥的VLPs 具有一定的藥物緩釋性能，72 h 的藥物累計釋放量達到80%。