電泳沉積技術制備海藻酸鈣-納米銅復合抗菌膜

2020-06-03 12:58:16雷雨，屈雪

功能高分子學報 2020年3期

雷雨，屈雪

（華東理工大學材料科學與工程學院，教育部醫用生物材料工程研究中心，上海 200237）

隨著耐藥性細菌的出現，傳統的抗菌手段已面臨十分嚴峻的挑戰[1,2]。目前，新型抗菌材料的研究和產品開發主要圍繞抗菌肽和金屬離子展開。大多數抗菌肽通過高選擇性和特異性靶向細胞質和干擾細胞代謝來發揮作用，但是抗菌肽生產成本高，體內穩定性差。許多金屬納米粒子被發現具有高效抗菌性能[3,4]，比如銀和銅。盡管銀的抗菌活性強，但是作為外來重金屬，它的遠期生物安全性一直為人們所擔憂[5]。銅是生物體生理學和基礎代謝的必需微量元素[6]，人體每天需要攝入約1 mg 銅。銅是眾多生物體內酶的結構組分和催化中心，比如皮膚中的超氧化物歧化酶依賴于銅。銅還能加速上皮組織生長，誘導血管內皮生長因子促進成血管化[6]。

銅對各種真菌、寄生蟲甚至病毒都具有殺滅性[6]，主要的作用機理是：Cu2+和Cu+的氧化還原循環能催化羥基自由基的生成（局部芬頓（Fenton）反應），進而對細菌膜脂質、DNA 進行超氧化破壞[7]；Cu2+能插入DNA的胞嘧啶-鳥嘌呤（G-C）堿基對，破壞氫鍵；Cu2+特異性攻擊蛋白質雙功能酪氨酸磷酸酶（VHR），氧化其半胱殘基，同時還攻擊細菌蛋白質和多肽鏈中的組氨酸、脯氨酸，消耗細菌細胞膜中的還原性谷胱甘肽[7]；Cu2+也與細菌表面的負電區域發生靜電作用，選擇性地撕裂菌膜表面[7]。

目前，很多學者研究了銅的不同化學形式產生的抗菌效果，包括純銅[7]、銅合金（如黃銅）[7,8]、銅離子[9]、難溶銅鹽[10]、銅離子配合的雜環化合物[11]、納米銅[12-14]、納米氧化銅[15-17]、硫化銅納米量子點[18]、納米銅-鎳合金[19]、含Cu2+的納米殼聚糖凝膠[20]、嵌入納米銅的海泡石微球[21]、含銅的納米硅球[22]、銅離子螯合的天然染料[23-26]、嵌入納米氧化銅的纖維織品[6]等。張俐娜課題組[27]制備了納米銅涂覆的纖維素膜，該纖維膜具有高效抗菌活性。Villanueva 等[28]合成了氧化硅包覆的納米銅并保持了連續4 個循環的抗菌活性。

雖然上述工作用銅作為抗菌功能組分，但是制備方法復雜、耗時。因此本文擬將納米銅引入海藻酸鈣凝膠膜中，利用納米銅的抗菌功能，使創口敷料獲得抗菌活性。具體借助電泳沉積技術，以碳酸鈣-海藻酸（Alg）-納米銅混合體系為電解液主要成分，在陽極誘導海藻酸鈣（Ca2+-Alg）-納米銅復合膜（Ca2+-Alg-Cu）的形成，并對膜的表觀形貌、化學結構、抗菌性能和體外細胞相容性進行了初步研究和分析。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

海藻酸鈉：分析純，上海阿拉丁化學試劑有限公司；納米銅（Cu NPs, 粒徑小于50 nm）、噻唑蘭（MTT）：分析純，Sigma-Aldrich 化學品公司；氯化鈉、碳酸鈣、十二水合磷酸氫二鈉、一水合磷酸二氫鉀、二甲基亞砜（DMSO）：分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；杜爾貝科的改良伊格爾培養基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素溶液、胰蛋白酶：生物試劑純度，Hyclone 生物試劑有限公司。

冷凍干燥機：寧波新芝生物科技公司Scientz-10N 型；電化學工作站：上海辰華儀器公司CHI 660E 型；鉑片電極：上海辰華儀器公司，15 mm×15 mm×0.2 mm；Ag/AgCl 電極：上海辰華儀器公司CHI 111 型；鉑絲電極：上海辰華儀器公司CHI 115 型；高壓滅菌鍋：上海申安醫療機械廠LDZX-50KBS 型；細胞培養箱：美國賽默飛世爾科技公司SERIES 8000W 型；酶標儀：美國分子器械公司SPECTRA max 384 型；掃描電子顯微鏡（SEM）：日本日立公司S4800 型，噴金40 s，電壓10 kV；能譜儀（EDS）：牛津儀器Ultim，EXTREME 無窗型電制冷；傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）：美國熱電公司Nicolet 5700 型，測定波數范圍為650～4 000 cm?1。

1.2 陽極電泳沉積制備Ca2+-Alg-Cu

各樣品按表1 配制電解液，將電解液攪拌10 min 后放入超聲機中超聲處理5 min，使納米銅充分分散，再繼續攪拌10 min。將上述混合液倒入50 mL 的燒杯，打開電化學工作站，用三電極體系（陰極和陽極都是鉑片電極，參比電極是Ag/AgCl 電極）以恒電流模式進行電泳沉積，電流密度為4.44 mA/cm2，通電電量是1.8 C。沉積結束后，用去離子水沖洗沉積的納米銅膜，用鑷子將膜剝離下來，并放在干凈的培養皿中，放入冷凍干燥機中干燥24 h 后，置于干燥器或者冰箱冷藏室中待用。

表 1 海藻酸鈣-納米銅電解液的組成Table 1 Composition of calcium alginate-copper nanoparticles electrolyte

1.3 Ca2+-Alg-Cu 的抗菌性能表征

1.3.1 平板計數法用生理鹽水將菌液梯度稀釋至約107CFU/mL 或106CFU/mL，24 孔板每孔加入1 mL菌液和Ca2+-Alg 或Ca2+-Alg-Cu 膜，以只加入1 mL菌液的樣品為空白對照，放入37 ℃恒溫培養箱內共培養12 h。用生理鹽水將共培養菌液梯度稀釋，取100 μL菌液滴在固體瓊脂平板上，輕輕震蕩使菌液均勻鋪滿平板，將平板放入37 ℃恒溫培養箱內培養15 h，記錄形成的菌落數，計算殺菌率，每組樣品設置3 個平行樣。

1.3.2 細菌的形貌表征將空白對照組菌液與Ca2+-Alg 或Ca2+-Alg-Cu 共培養12 h 的菌液（1 mL）高速離心，去除500 μL 上清液，加入1 mL w=2.5%的戊二醛溶液，靜置固定2～3 h。高速離心5 min，去除部分上清液，加入1 mL w=30%的酒精，靜置10 min 后再高速離心5 min，依次用w= 50%，75%，85%，90%，100%的酒精進行10 min 梯度脫水，最后加入乙酸異戊酯置換酒精。將脫水后的菌液滴在硅片上，放入冷凍干燥機中凍干24 h。將硅片黏在導電膠上，通過SEM 觀察細菌形貌。

1.4 Ca2+-Alg-Cu 的細胞相容性表征

將小鼠成纖維細胞（L929）以每孔2×104cells 的細胞密度接種到12 孔板后，把孔板放到細胞培養箱24 h后至細胞貼壁。接著在培養孔中加入新鮮制備的Ca2+-Alg-Cu 培養24 h 后，去除膜材料，在避光條件下向每孔加入200 μL 噻唑蘭溶液，把孔板放回細胞培養箱4 h 后，吸取上清液，向每孔加入1 mL DMSO，37 ℃恒溫箱中培養10 min 使紫色結晶完全溶解，吹打均勻后取100 μL 溶液至96 孔板，放入酶標儀測定492 nm 波長的吸光度。實驗數據用OriginLab 作圖。每組設置3 個平行樣。

圖 1 Ca2+-Alg 和Ca2+-Alg-Cu 的照片Fig. 1 Photographs of Ca2+-Alg and Ca2+-Alg-Cu

2 結果與討論

2.1 Ca2+-Alg-Cu 的電化學制備及表面形貌

陽極沉積形成的膜如圖1 所示。Ca2+-Alg 呈白色，而Ca2+-Alg-Cu10，Ca2+-Alg-Cu20 和Ca2+-Alg-Cu50 呈現逐漸變深的綠色，可能是由于納米銅的加入能夠增加材料的折射率，使膜顏色逐漸加深，也可以據此定性判斷出納米銅含量在各種膜中的變化。

圖2 是Ca2+-Alg 和Ca2+-Alg-Cu 的SEM 表面形貌。隨著Cu 含量的增加，Ca2+-Alg-Cu 表面的粗糙度逐漸增加，納米團簇的密度越來越大，表面的顏色越來越暗。同時一些不光滑、褶皺和類似氣泡的結構出現，可能是在陽極附近水電解產生氧氣，同時碳酸鈣溶解時釋放出一些CO2，兩種氣體同時在電極附近存在，使沉積出來的樣品膜出現氣泡樣形貌。

圖 2 Ca2+-Alg 和Ca2+-Alg-Cu 的SEM 照片Fig. 2 SEM images of Ca2+-Alg and Ca2+-Alg-Cu

2.2 Ca2+-Alg-Cu 的化學結構表征

Ca2+-Alg-Cu 的EDS 元素分析結果如圖3 所示。可以看出，只有加入納米銅的實驗組出現了銅元素的峰，說明納米銅成功地包入了海藻酸鈣膜，而且隨著納米銅含量的增加，Cu 元素信號峰的強度增強。

Ca2+-Alg 和Ca2+-Alg-Cu 的紅外譜圖如圖4 所示。圖中1 597 cm?1處的峰對應COO?的不對稱伸縮振動，1 410 cm?1處的峰對應COO?的對稱伸縮振動，1 300 cm?1處的峰對應C―O（H）鍵，1 120 cm?1處的峰對應C―C 的伸縮振動，1 084 cm?1處的峰對應古羅糖醛酸中C―O 的伸縮振動，1 030 cm?1處的峰對應C―O―C基團，935 cm?1處的峰對應古羅糖醛酸中受到C―C―H 和C―O―H 形變影響的C―O 鍵，887 cm?1對應甘露糖醛酸中的C―C―O 和C―O―C 基團，810 cm?1處的峰對應甘露糖醛酸中的C―O 基團，776 cm?1處的峰對應C―H 鍵的平面外彎曲振動。可以看到，隨著納米銅含量的增加，1 597 cm?1處COO?的不對稱伸縮振動峰強度和1 410 cm?1處對稱伸縮振動峰強度都在減弱，說明納米銅會與海藻酸鈣中的羧酸根離子COO?相互作用，從而弱化信號峰的強度。

圖 3 Ca2+-Alg 和Ca2+-Alg-Cu 的EDS 圖譜Fig. 3 EDS spactra of Ca2+-Alg and Ca2+-Alg-Cu

圖 4 Ca2+-Alg 和Ca2+-Alg-Cu 的紅外吸收光譜Fig. 4 FT-IR spactra of Ca2+-Alg and Ca2+-Alg-Cu

同時，1 300 cm?1處C―O（H）鍵的信號峰也隨著納米銅含量的增加逐漸消失，說明納米銅也會與海藻酸鈣中的羥基相互作用。值得注意的是，1 030 cm?1處C―O―C 的紅外吸收峰強度隨著納米銅加入量的增加而減弱，說明納米銅除了可以與海藻酸鈣中的羥基和羧基反應外，還可以與醚鍵發生相互作用。最后，887 cm?1處甘露糖醛酸中的C―C―O 和C―O―C 基團的吸收峰強度隨著膜中納米銅含量的增加而減弱，說明納米銅主要與海藻酸鈣中的甘露糖醛酸鏈段發生反應，而基本不與海藻酸鈣中的古羅糖醛酸鏈段反應，說明古羅糖醛酸鏈段主要用于和碳酸鈣解離出的鈣離子發生離子交聯反應，形成雞蛋盒子結構，而未參與離子交聯的甘露糖醛酸鏈段參與了和納米銅的相互作用。

2.3 Ca2+-Alg-Cu 的抗菌性能評價

2.3.1 平板計數法將大腸桿菌（E. coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）分別作為革蘭氏陰性菌模型和革蘭氏陽性菌模型，細菌濃度為1×107CFU/mL。細菌與Ca2+-Alg、Ca2+-Alg-Cu 共培養2 h 后的膜片顏色變化如圖5 所示。經過2 h 的培養后，Ca2+-Alg-Cu 的綠色逐漸褪去變成白色，說明原本包在Ca2+-Alg-Cu 中的納米銅顆粒逐漸釋放到菌液里。

圖 5 Ca2+-Alg-Cu 在37 ℃ E. coli 菌液中的顏色變化Fig. 5 Color fading of Ca2+-Alg-Cu in E. coli suspension at 37 ℃

細菌生長情況如圖6 所示，空白對照組和Ca2+-Alg 都不能抑制細菌生長，而Ca2+-Alg-Cu10、Ca2+-Alg-Cu20、Ca2+-Alg-Cu50 均能抑制細菌生長，且隨著納米銅用量的增加，抗菌效果逐漸增強，說明納米銅對細菌的生長和繁殖具有顯著的抑制作用。

圖 6 Ca2+-Alg-Cu 與高濃度（1×107 CFU/mL）E. coli 共培養后的菌落Fig. 6 E. coli colony after high turbidity（1×107 CFU/mL） bacterial suspension incubated with Ca2+-Alg-Cu

將圖6 中的菌落數轉換為細菌存活率柱狀圖（圖7）。可以看出，Ca2+-Alg-Cu 的殺菌活性隨著納米銅用量的增加而增加，Ca2+-Alg-Cu50 的殺菌率高達100%。

采用低濃度（1×106CFU/mL）的3 種常見細菌（E.coli、 S. aureus 和綠膿桿菌（P. aeruginosa））測試Ca2+-Alg-Cu的抗菌活性，實驗結果見圖8。結果表明，即使是Ca2+-Alg-Cu10 也能產生約100%的殺菌率，這種材料對常見細菌具有高效廣譜殺菌性能。

圖 7 用高濃度（1×107 CFU/mL）E. coli 與Ca2+-Alg-Cu 共培養2 h 的細菌存活率Fig. 7 Surviving rate of E. coli in high initial turbidity（1×107 CFU/mL） after incubation with Ca2+-Alg-Cu for 2 h

圖 8 用低濃度（1×106 CFU/mL）細菌與Ca2+-Alg-Cu 共培養2 h 的細菌存活率Fig. 8 Surviving rate of bacteria in low initial turbidity（1×106 CFU/mL） after incubation with Ca2+-Alg-Cu for 2 h

2.3.2 細菌的形貌表征圖9 為與Ca2+-Alg-Cu50 共培養2 h 后的細菌形貌SEM 照片。E. coli 和S. aureus 嚴重變形，表面出現褶皺，說明Ca2+-Alg-Cu50 在殺菌過程中也會改變細菌形貌。

圖 9 Ca2+-Alg-Cu50 處理E.coli 和S.aureus 前后的SEM 照片Fig. 9 SEM images of Ca2+-Alg-Cu50 before and after treated E. coli and S. aureus

2.4 Ca2+-Alg-Cu 的細胞相容性評價

體外細胞相容性實驗結果如圖10 所示。隨著納米銅含量的增加，細胞存活率逐漸降低。Ca2+-Alg 和Ca2+-Alg-Cu10 處理的L929 存活率均高于80%，分別為98%和83%；而在Ca2+-Alg-Cu20 和Ca2+-Alg-Cu50 處理組，L929 存活率低于80%，分別為75%和40%。經過24 h 處理，L929 的有效線粒體數隨著膜中納米銅含量的增加而降低，意味著存活狀態細胞比例在降低，細胞毒性逐漸增加。表2為與Ca2+-Alg-Cu 共培養的E. coli 以及L929 的存活率。由表可見，Ca2+-Alg 對E. coli 沒有抑菌作用，E. coli 的存活率增加到108%，而L929 的存活率為100%。相反，與 Ca2+-Alg-Cu50 共孵育24 h 后，L929 的存活率只有39%，而E. coli 的存活率低至1%。Ca2+-Alg-Cu20 和Ca2+-Alg-Cu10 能夠實現低于20%的E. coli 存活率和大于75%的L929 存活率。

圖 10 Ca2+-Alg-Cu 與L929 共培養后的細胞存活率Fig. 10 Surviving rate of L929 incubated with Ca2+-Alg-Cu

眾所周知，納米材料的體外生物相容性具有時間和劑量依賴性，而本文驗證了納米銅在電泳沉積膜中的含量增加會導致細胞存活率下降，即具有劑量依賴性。同時，值得注意的是，L929 相比人細胞對納米銅的敏感度可能更高，而且納米銅作用下的細胞存活率與膜材料和細胞共培養的時間有關。共培養24 h 的細胞存活率說明Ca2+-Alg-Cu10 和Ca2+-Alg-Cu20 具備優良的細胞相容性，而Ca2+-Alg-Cu50的細胞相容性可能需要做更長期的體外實驗來研究，因此Ca2+-Alg-Cu 的體外生物毒性需要進一步研究確認。