響應面優化大孔樹脂純化太行菊總黃酮及其降糖活性

葛水蓮，陳建中, *，劉娜 ，楊明建，侯騰飛

1. 邯鄲學院生命科學與工程學院（邯鄲 056005）；2. 衡水學院化工學院（衡水 053000）；3. 韓國又石大學制藥化妝品工程系（完州 55338）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）已成為一個全球性的公共健康問題。2017年國際糖尿病聯盟公布了第八版的全球糖尿病地圖，數據顯示全球糖尿病患者（20～79歲）超過4.25億，其中我國的糖尿病患者數量居全球第一位，高達1.14億[1-3]。DM危害極大，但至今缺乏安全性和依從性高且長效的治療方法[4-5]。近年來國內外學者高度關注安全有效的降糖物質天然黃酮，但不同來源的天然黃酮其成分與功效截然不同[6]。太行菊（Opisthopappus taihangensis）為中國特有珍稀物種，叢生于海拔1 000 m的峭壁之上，多抗旱且耐寒，主要分布于河南、山西、河北三省太行山南麓。太行菊全株通體富含芳香油，干后香味持久，經水蒸的太行菊花陰干后具有清肝明目和清熱潤喉的功效，作為藥食兩用的野生資源植物具有較高開發價值。現階段太行菊的研究普遍停留在提取工藝[7]和種質資源應用方面[8-9]，而對太行菊黃酮（以下簡稱FOT）的降糖活性研究較少。此次試驗分析FOT的最佳樹脂純化條件，探究FOT的降血糖作用機制，旨為新型天然抗糖尿病藥物和保健食品的研發提供的藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試太行菊源自河北涉縣偏城鎮和合漳鄉的河北地區野生種長裂太行菊。于開花前采集地上部分，采時株高4～10 cm。太行菊全株洗凈塵土，鼓風干燥箱中60 ℃烘干至恒質量，粉碎過60目篩后備用。蘆丁標準品，大孔吸附樹脂（AB-8、D-101、DA-201、DM-301），試劑和藥品分析純。

1.2 太行菊總黃酮標準曲線繪制

黃酮濃度測定：吸取1 mL供試樣液，用70%乙醇定容至5 mL，加0.3 mL 5%的NaNO2，搖勻后靜置10 min；加0.3 mL 10%的A1(NO3)3，搖勻后靜置10 min；加4 mL 4%的NaOH，最后10 mL容量瓶定容，搖勻靜置20 min，測定試樣吸光度[10]。

1.3 大孔樹脂性能測定

稱取1 g已預處理的4種AB-8型、D-101型、DA-201型、DM-301型大孔樹脂，分別置于250 mL三角瓶中，分別加入3.97 mg/mL的總黃酮提取液，各100 mL，放置于恒溫振蕩箱中（25 ℃，60 r/min）靜態吸附24 h。稱取0.1 mL樣液，測定其吸光度，計算相應的黃酮濃度[11]。按公式計算靜態吸附量[12]。

式中：Q為靜態吸附量，mg/g；C0為初始濃度，mg/mL；CV為剩余質量濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；W為樹脂質量，g。

將吸附飽和的樹脂用布氏漏斗進行分離，用去離子水沖洗并抽濾，然后置于250 mL三角瓶中，加入80 mL 90%乙醇溶液。放置于恒溫振蕩箱中（25 ℃，60 r/min）靜態洗脫24 h。然后將樹脂抽濾出，稱移0.1 mL剩余液體測吸光度，計算黃酮濃度，按公式計算解吸率[13-14]。

式中：Z為解吸率，%；C為解吸液質量濃度，mg/mL；V為解吸液體積，mL；Q為靜態吸附量，mg/g；M為樹脂質量，g[14]。

1.4 太行菊黃酮對糖尿病小鼠血糖干預模型的建立

選取健康ICR小鼠，適應性飼養1周后禁食不禁水12 h，稱質量后，隨機抽取10只作空白對照組[15]。處理組小鼠按150 mg/kg劑量尾靜脈注射新配制的四氧嘧啶生理鹽水溶液（STZ），注射空白對照組小鼠等量緩沖液[16-17]。恢復飲食72 h后稱質量，禁食不禁水12 h斷尾采血。用葡萄糖試劑盒測定小鼠空腹血糖（FPG），凡FPG≥11.1 mmol/L視為糖尿病小鼠模型[18]。將糖尿病模型鼠依據血糖值的均衡原則分成5組：模型組、陽性對照組（鹽酸二甲雙胍）、太行菊黃酮高劑量組（200 mg/kg）、太行菊黃酮中劑量組（150 mg/kg）、太行菊黃酮低劑量組（100 mg/kg）。從第2天開始每天灌胃處理相應藥物，而空白對照組和模型組均給與等量蒸餾水，陽性對照組按150 mg/kg灌胃鹽酸二甲雙胍，每周測3次空腹血糖值，連續給藥4周[19]。研究期間保持小鼠飼養環境條件符合GB 14923—2010[20]，按動物試驗3R原則予以小鼠人道關懷。

2 結果與分析

2.1 大孔吸附樹脂靜態吸附與解吸試驗

試驗所選擇4種大孔樹脂的篩選試驗結果見表1。AB-8型樹脂對太行菊總黃酮的吸附率和解吸率均較高。DM-301，DA-201和D-101的吸附率和解吸率均不高。所以選用AB-8型大孔樹脂純化太行菊總黃酮的粗提液。

表1 大孔吸附樹脂靜態吸附性能

2.2 響應面試驗設計

2.2.1 因素的選取及方案

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，固定乙醇體積分數95%，每次裝柱10 mL樹脂進行試驗。三因素選取：2，2.5和3 mg/mL上樣液濃度（A）；1，2和3 mL/min上樣液流速（B）；1，2和3 mL/min乙醇流速（C）。設計三因素三水平的響應面分析試驗方案，以太行菊總黃酮回收率為響應值（R），進行響應面分析試驗。采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計分析，試驗方案及結果見表2。

2.2.2 三因素響應面模型建立與顯著性檢驗

三因素對FOT回收率的影響不是簡單的線性關系。為明確各因素對響應值的影響，采用Design-Expert 8.0.6對試驗結果進行響應面二次回歸擬合：黃酮回收率R=76.66+4.26A-4.10B-1.97C-1.92AB-0.25AC-0.34BC-0.49A2-8.04B2-2.54C2。方程中各項系數絕對值的大小反映了各因素對響應值的影響強弱，系數的正負反映了影響的方向。影響FOT回收率的主次順序為：上樣液濃度＞上樣液流速＞乙醇流速。回歸模型及系數顯著性檢驗結果見表3，回歸模型極顯著（p=0.000 6＜0.01），失擬項不顯著（p=0.330 6＞0.05），表明回歸方程對試驗擬合度較高，誤差對試驗結果影響很小。試驗得到的模型擬合程度良好，試驗誤差小，可用該回歸方程擬合試驗真實點進行分析和預測FOT回收率。在總的作用因素中，A的一次項、B的一次項和二次項對響應值R影響達到極顯著水平（p＜0.01），C的一次項和二次項對R影響達到顯著水平（p＜0.05），表明這兩個因素對太行菊總黃酮回收率的線性效應顯著。而方程的AB、AC、BC的交互項和上樣液濃度的二次項對R影響均未達到顯著水平（p＞0.05）。

表2 響應面試驗方案及試驗結果

表3 響應面試驗方差分析

2.2.3 AB-8樹脂純化太行菊黃酮的三因素間的交互作用

結合Box-Behnken試驗設計方案，研究不同因素之間對總黃酮回收率的影響。根據回歸方程得出不同因素的響應面分析圖及相應等高線圖，見圖1～圖3。從響應面分析圖上可較直觀地看出各因素交互作用對響應值的影響。若相應曲面陡峭則交互作用顯著，等高線的密度越大，則條件的變化對響應值的影響越顯著。等高線為橢圓形表示交互作用影響顯著，為圓形則不顯著[21]。圖1中沿A軸向等高線相對密集，表現為曲線陡峭，說明上樣液濃度對總黃酮回收率影響顯著；沿B軸向等高線相對稀疏，表現為曲線較平滑，說明上樣液流速對總黃酮回收率影響不顯著。由等高線圖為橢圓形可知，上樣液濃度與上樣液流速的交互作用極為顯著。同理圖2中上樣液濃度對總黃酮回收率影響顯著；乙醇流速對總黃酮回收率影響不顯著。上樣液濃度和乙醇流速的交互作用極為顯著，表現為等高線密集。圖3中B和C兩個因素向等高線相對稀疏，表現為曲線較平滑。由等高線圖為圓形可知，上樣液濃度與乙醇流速的交互作用不顯著。

圖1 上樣液濃度和上樣液流速交互對黃酮回收率的響應面圖

圖2 上樣液濃度和乙醇流速交互對黃酮回收率的響應面圖

圖3 上樣液流速和乙醇流速交互對黃酮回收率的響應面圖

2.2.4 AB-8樹脂純化太行菊黃酮提取工藝條件的確定

為了確定最佳點的值，對模型進行分析，以得到最高總黃酮回收率的最佳純化工藝條件，經分析得出最佳純化條件，結果見表4。最佳的分離純化工藝條件為上樣液質量濃度2.9 mg/mL、上樣液流速1.6 mL/min、乙醇流速1.4 mL/min。此條件下太行菊總黃酮回收率理論值達81.40%。

2.3 FOT對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

表5為FOT對糖尿病小鼠空腹血糖的影響。STZ注射建模后，與正常組比，模型組及其他各組小鼠空腹血糖顯著上升，差異達到極顯著水平（p＜0.01）；灌胃1周后，與模型組相比，FOT各劑量組及藥物組血糖明顯降低（p＜0.05）；與模型組對比，小鼠灌胃4周后，太行菊黃酮高、中、低劑量組及藥物組空腹血糖持續下降并接近正常組。

表4 響應面模型提取工藝優化值

表5 太行菊總黃酮對T2DM小鼠血糖水平的影響（x±s） mmol/L

3 結論與討論

利用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken設計，通過改變不同的過柱條件獲得回收率，進而構建純化條件的響應面，并運用響應面法分析得到太行菊總黃酮的最佳純化條件。研究上樣液濃度（A）、上樣液流速（B）、乙醇流速（C）三因素對太行菊總黃酮回收率的影響，建立純化工藝的二次多項式數學模型，分析了各因素對響應值的影響。結果表明，模型擬合度高，試驗誤差小，最佳的分離純化工藝條件為上樣液質量濃度2.9 mg/mL、上樣液流速1.6 mL/min、乙醇流速1.4 mL/min。此條件下太行菊總黃酮回收率理論值達81.40%。

四氧嘧啶造模法是一種Ⅱ型糖尿病模型制備的經典方法，通過尾靜脈注射后小鼠血糖在長時間處于較高水平。結果顯示，造模小鼠與正常小鼠相比，血糖水平均顯著上升，同時出現“三多一少”的癥狀，小鼠毛發粗糙、精神不振，試驗結果可信度高。STZ注射建模后，FOT對糖尿病小鼠空腹血糖的影響，參比模型組對糖尿病小鼠具有顯著降血糖作用，并呈現顯著的劑量效應關系，表明FOT能通過提高機體抗氧化功能，抑制氧自由基，從而降低糖尿病的血糖水平。雖然這些研究還處于實驗室階段，但這也為太行菊的開發應用提供了藥理學依據。但黃酮在生物體內代謝作用途徑更為復雜，因此太行菊黃酮的降糖機制值得深入研究。