酶法處理油茶籽殼制備低聚木糖工藝的優(yōu)化

張立釗 ，盧昌麗，陳力力 *，熊香元 ，龔慧可

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院（長沙 410128）；2. 食品科技和生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（長沙 410128）；3. 湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心（長沙 410128）

油茶籽殼中的纖維素、木質(zhì)素、半纖維素、蛋白質(zhì)、脂肪和茶皂素等含量較高，含量分別是23.45%，21.56%，9.70%，3.24%，3.69%和5.17%，將這些植物纖維素廢料經(jīng)水解則可制得低聚木糖[1]。生產(chǎn)低聚木糖的植物性原料種類多樣，數(shù)量眾多，通常如玉米芯、甘蔗渣、稻殼及其他種子皮殼禾桿等都是制取低聚木糖的理想原料[2]，由此看出油茶籽殼也可以作為原材料制取低聚木糖。隨工業(yè)發(fā)展，將副產(chǎn)物油茶籽殼作為原料可以生產(chǎn)出醋酸鈉、拷膠、單寧等化學(xué)物質(zhì)[3]，而油茶籽殼被使用于生產(chǎn)低聚木糖卻很少見。

將木聚糖經(jīng)過物理或化學(xué)方法降解可形成低聚木糖，徹底反應(yīng)可得單糖，其中大部分為木糖。低聚木糖是2～10個(gè)木糖分子形成低度聚合五碳糖的總稱，又稱木寡糖[4]。低聚木糖用途非常廣泛，主要用于生產(chǎn)木糖醇或飼料，在多個(gè)工業(yè)部門被廣泛應(yīng)用：在醫(yī)藥工業(yè)，低聚木糖可以治療高血壓、高血脂、糖尿病和肝炎等，還可以生產(chǎn)血漿保存劑，具有防蛀牙的作用；在化工工業(yè)上，低聚木糖可用于生產(chǎn)燃料、增塑劑、油漆涂料；在食品工業(yè)中，低聚木糖可作為甜味劑、風(fēng)味改良劑、抗氧劑和其他香精料等[5]。

試驗(yàn)開展堿預(yù)處理方法，制備油茶籽殼木聚糖及其酶解處理制備低聚木糖的研究，旨在為提高油料加工副產(chǎn)物油茶籽殼的附加值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶籽殼：產(chǎn)自廣西百色地區(qū)，剔除雜質(zhì)后籽殼分離，將茶籽殼40 ℃烘至恒質(zhì)量，打成殼粉（200目篩）后，進(jìn)行真空包裝，放置冰箱冷藏貯存?zhèn)溆谩?/p>

木聚糖酶（酶活6 000 U/mg，上海廣銳生物科技有限公司）；D-木糖（上海瑞永生物科技有限公司）；濃氨水、酒石酸鉀鈉、酚酞、濃硫酸、氫氧化鈉、苯酚、亞硫酸鈉等（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；SW-CJ-1FD無菌操作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；AUY220電子天平（島津制作所）；LDZX-50KBS立式高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；722N分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 測定指標(biāo)及測定方法

木聚糖、低聚木糖的測定：采用DNS法[6]，提取率及低聚木糖濃度計(jì)算參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.2 堿法制備木聚糖粗提液

稱取50 g制備的油茶籽殼殼粉，倒入1 000 mL錐形瓶中，并加入5%氨水，控制固液比1∶10（g/mL），在60 ℃的恒溫條件下浸泡12 h；隨后過濾留下濾渣，用自來水反復(fù)沖洗，直至洗液清澈。將上述濾渣再加入蒸餾水，使固液比1∶10（g/mL），放置于170 ℃下密封并蒸煮2 h，過濾收集濾液，測定木聚糖的含量。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮達(dá)到適當(dāng)濃度。

1.3.3 酶法制備低聚木糖單因素試驗(yàn)

取5 mL木聚糖粗提液，以木聚糖作為底物，用木聚糖酶進(jìn)行酶解。以酶添加量3%、酶解時(shí)間6 h、酶解溫度50 ℃、底物濃度5 g/L作為基礎(chǔ)酶解條件。以低聚木糖濃度為考核指標(biāo)，對(duì)酶添加量（1%，2%，3%，4%和5%）、酶解時(shí)間（2，4，6，8和10 h）、酶解溫度（40，45，50，55和60 ℃）和底物濃度（5，10，15，20和25 g/L）4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)低聚木糖濃度的影響。

1.3.4 酶法制備低聚木糖響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以低聚木糖濃度（Y）為響應(yīng)值，選取酶添加量（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）和底物濃度（D）4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)以優(yōu)化酶解工藝[8]，Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

表1 油茶籽殼酶解制備低聚木糖響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行繪圖和數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異性顯著性分析，響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖粗提液提取率

通過堿法處理，獲得木聚糖粗提液，其濃度為5.15 g/L，提取率為53.12%。經(jīng)濃縮，得到10，15，20和25 g/L不同濃度的木聚糖原液。

2.2 酶解制備低聚木糖單因素結(jié)果比較

2.2.1 酶使用量對(duì)低聚木糖提取的影響

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，一開始隨著木聚糖酶量的增加，濃度曲線快速升高，木聚糖酶使用量4%時(shí)，低聚木糖濃度達(dá)到最高峰值，之后隨著木聚糖酶使用量加大，曲線變化趨勢(shì)不明顯，且有下降趨勢(shì)。在一定情況下，越多的木聚糖酶就有越高產(chǎn)物濃度，曲線圖幾乎呈線性相關(guān)。但是，酶使用量增加到糖降解反應(yīng)徹底時(shí)，線性關(guān)系被打破，低聚木糖濃度曲線不再升高，若此時(shí)繼續(xù)添加木聚糖酶，會(huì)造成不必要的浪費(fèi)。因此4%是木聚糖酶的最適添加量，此條件下酶解后低聚木糖濃度為4.25 g/L。

圖1 不同酶使用量對(duì)低聚木糖濃度的影響

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)低聚木糖提取的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。在8 h內(nèi)隨著反應(yīng)時(shí)間的不斷加大，低聚木糖濃度曲線不斷上升，8 h時(shí)濃度達(dá)到最大值，之后濃度呈下降趨勢(shì)。隨著反應(yīng)不斷進(jìn)行，低聚木糖濃度不斷增加，使得對(duì)正反應(yīng)的抑制作用不斷增強(qiáng)。而且，剛開始進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，酶與無定形區(qū)的纖維素更容易反應(yīng)并催化水解，但繼續(xù)反應(yīng)難以滲透到結(jié)晶區(qū)，在結(jié)晶區(qū)的纖維素分子慢速水解，產(chǎn)物濃度增加緩慢。因此，酶解最適反應(yīng)時(shí)間是8 h，此條件下酶解后低聚木糖濃度為3.69 g/L。

2.2.3 酶解溫度對(duì)低聚木糖提取的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。低聚木糖濃度隨著反應(yīng)溫度梯度的增大而明顯增大，50 ℃時(shí)濃度到達(dá)最大峰值，溫度大于50 ℃后濃度曲線幾乎呈直線下降。這是由于反應(yīng)溫度對(duì)酶有很強(qiáng)的敏感性，其會(huì)影響自身的蛋白穩(wěn)定性和催化能力。溫度過低，反應(yīng)中木聚糖酶催化降解過程受到抑制；溫度過高，影響木聚糖酶蛋白穩(wěn)定性，也加快酶活力下降的速度，使反應(yīng)不能徹底。因此，選擇酶解溫度50 ℃為最適溫度，此條件下酶解后低聚木糖濃度為3.68 g/L。

圖2 不同酶解時(shí)間對(duì)低聚木糖濃度的影響

圖3 不同酶解溫度對(duì)低聚木糖濃度的影響

2.2.4 底物濃度對(duì)低聚木糖提取的影響

從圖4可以發(fā)現(xiàn)，一開始隨著底物濃度增加，低聚木糖濃度曲線逐漸升高，底物濃度25 g/L時(shí)低聚木糖濃度達(dá)到最高峰值，之后隨著加大底物濃度，曲線變化趨勢(shì)不明顯，且有下降趨勢(shì)。在一定情況下，越高底物濃度就有越高產(chǎn)物濃度，底物濃度增加到所有酶都參與糖降解反應(yīng)時(shí)，線性關(guān)系被打破，低聚木糖濃度曲線不再升高，若繼續(xù)提高底物濃度，會(huì)造成不必要的浪費(fèi)。因此選擇底物濃度20 g/L為最適濃度，此條件下酶解后低聚木糖濃度為10.60 g/L。

2.3 木聚糖酶解工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以低聚木糖濃度（Y）為響應(yīng)值，選取酶添加量（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）、底物濃度（D）4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝，選取四因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

通過Design Expert 8.0.6軟件對(duì)29組試驗(yàn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，并進(jìn)行回歸方程擬合，得到各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值影響的多元二次回歸方程：Y=81.54+5.81A-0.057B-0.58C-6.11D-2.500E-003AB+0.027AC+2.90AD-0.12BC+0.19BD+0.17CD+0.52A2-0.38B2-4.00C2+0.84D2。

不同因素以及其不同水平處理對(duì)低聚木糖濃度的影響較大，線性范圍在4.52～11.52 g/L之間，因此優(yōu)化各因素組合能顯著提高低聚木糖濃度。

由表3可知，模型p＜0.000 1，說明回歸模型效果極顯著[9]。模型失擬項(xiàng)p值為0.072 8＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明模型比較穩(wěn)定，擬合良好，誤差小。此模型可以包括所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并且可以忽略試驗(yàn)誤差。決定系數(shù)R2=0.994 6，校正決定系數(shù)R2adj=0.989 2，表明模型可以解釋試驗(yàn)98.92%的響應(yīng)值變化。一次項(xiàng)A、C、D，二次項(xiàng)A2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（p＜0.01），交互項(xiàng)AD、AC對(duì)結(jié)果影響顯著（p＜0.05）。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

圖5 酶添加量和底物濃度的交互作用對(duì)低聚木糖濃度的影響

圖6 酶添加量和酶解溫度的交互作用對(duì)低聚木糖濃度的影響

通過Design Expert 8.0.6軟件分別作出酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、底物濃度交互作用的響應(yīng)曲面，結(jié)果見圖5和圖6。曲面圖越陡表示交互作用越強(qiáng)，曲面圖越平表示交互作用越弱。由圖5可知，酶添加量和底物濃度的交互作用對(duì)于低聚木糖濃度有顯著影響，由三維圖可以看出，低聚木糖濃度的變化均是隨兩者的增加而增加的，最高的低聚木糖濃度出現(xiàn)在酶添加量為5%附近，對(duì)應(yīng)的底物濃度為2%。由圖6可知，酶添加量和酶解溫度的交互作用對(duì)低聚木糖濃度的影響顯著，酶解溫度對(duì)低聚木糖濃度的影響比酶添加量更大。

通過Design Expert 8.0.6軟件分析得到最佳酶解工藝條件：酶添加量5%、酶解時(shí)間10 h、酶解溫度49.05℃、底物濃度20 g/L。此時(shí)低聚木糖濃度理論預(yù)測值為11.596 2 g/L。結(jié)合試驗(yàn)實(shí)際情況，最終選擇酶添加量5%、酶解時(shí)間10 h、酶解溫度49 ℃、底物濃度20 g/L。為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，采取優(yōu)化后的酶解條件做驗(yàn)證試驗(yàn)，設(shè)3次平行，低聚木糖濃度實(shí)際平均值為11.63 g/L，與理論預(yù)測值基本一致。

3 結(jié)論

主要對(duì)木聚糖酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過單因素試驗(yàn)研究酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、底物濃度對(duì)低聚木糖濃度的影響，選取較優(yōu)條件范圍，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以低聚木糖濃度為考核指標(biāo)，優(yōu)化酶解條件：酶添加量5%、酶解時(shí)間10 h、酶解溫度49 ℃、底物濃度2%。此優(yōu)化條件下，低聚木糖濃度為11.63 g/L，比未優(yōu)化前提高4.63 g/L。試驗(yàn)證明堿法提取木聚糖制備低聚木糖的可行性，可對(duì)企業(yè)的實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)低聚木糖提供理論依據(jù)。