金銀花綠原酸與蘆丁、槲皮素協(xié)同抗氧化作用

石艷賓*，鮑佳彤，王亦萱，李文靜

1. 天津天獅學(xué)院（天津 301700）；2. 天津嘉匯捷瑞醫(yī)藥科技有限公司（天津 301800）

金銀花為忍冬屬植物忍冬及同屬植物干燥花蕾，主要功效成分有綠原酸、黃酮、揮發(fā)性油、木樨草苷等[1-2]。金銀花在中國具備悠長的保健歷史與藥用歷史，是藥食兩用植物，具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌消炎、降血壓、延緩衰老、保肝利膽、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高免疫力等藥理作用[3]。Sato等[4]、李文娜等[5]指出杜仲葉綠原酸類物質(zhì)具有較高的抗氧化活性，能有效清除二苯代苦味酰肼自由基（DPPH）、超氧陰離子自由基、羥自由基（·OH）、烷基自由基，對缺血再灌注損傷細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。槲皮素、蘆丁是典型黃酮類物質(zhì)，能有效清除脂質(zhì)自由基、·OH、超氧陰離子自由基等，具備提高免疫力、抗衰老、降血糖血脂、抗心律失常、抗癌、殺菌等生理活性[6-7]。擺玉芬等[8]、周偉婧等[9]分析了番茄紅素與葡萄籽油、VE、原花青素及荔枝皮原花青素與VC、VE間協(xié)同抗氧化研究，研究表明在增加濃度的條件下復(fù)合抗氧化劑比單一組分的總活性的抗氧化能力強(qiáng)，主要是由于抗氧化成分之間常具備抗氧化協(xié)同的特征。黃酮與多酚類物質(zhì)、黃酮類化合物間具有協(xié)同抗氧化性[10-11]，以DPPH自由基清除能力為抗氧化能力的衡量指標(biāo)，分析槲皮素、蘆丁對金銀花綠原酸提取物的抗氧化增效作用，為酚類物質(zhì)與黃酮類物質(zhì)復(fù)配抗氧化劑開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠原酸、蘆丁、槲皮素（純度≥98%，中國藥品生物制品檢定研究院）；DPPH：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；VC、無水乙醇、甲醇（分析純，天津市匯杭化工科技有限公司）；金銀花（湖北明騰生物科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1000紫外可見分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；KQ-200VDV超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；TD5K-Ⅲ低速離心機(jī)（長沙東旺實驗儀器有限公司）；ME204E分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；PL403電子天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金銀花中綠原酸的提取工藝

1) 金銀花綠原酸的提取。稱取20 g金銀花粉末于錐形瓶中，按料液比1∶20（g/mL）加入70%乙醇溶液，在超聲功率200 W、溫度60 ℃下超聲提取25 min。將綠原酸超聲提取液冷卻至室溫后，在5 000 r/min下離心20 min，取其上清液于棕色試劑瓶中，冷藏備用。

2) 綠原酸含量的測定。配制質(zhì)量濃度為120 μg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取0，1，2，3，4，5和6 mL于25 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度，制成綠原酸標(biāo)準(zhǔn)待測溶液。以零管為空白參照，在波長328 nm處測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2值，并以此為依據(jù)計算金銀花綠原酸提取液的濃度。

1.3.2 清除DPPH自由基能力的測定

將按照1.3.1小節(jié)提取得到的金銀花綠原酸提取溶液、槲皮素溶液和蘆丁溶液，配制成一系列適宜濃度梯度的樣品溶液。取0.3 mL待測樣品溶液、0.6 mL 0.06 mol/L DPPH溶液，混合混勻，靜置反應(yīng)30 min后，在515 nm處測定系列樣品溶液的吸光度，作為系列樣品溶液反應(yīng)后Ar；在0.3 mL待測樣品溶液、0.6 mL 70%乙醇溶液反應(yīng)后，測定樣品底液Ax；在0.3 mL乙醇溶液、0.6 mL 0.06 mol/L DPPH溶液反應(yīng)后，得到空白對照Ac[12]。根據(jù)式（1）計算金銀花綠原酸提取溶液、槲皮素溶液、蘆丁溶液的DPPH自由基清除率SR值。依據(jù)金銀花綠原酸、槲皮素、蘆丁系列濃度樣品溶液SR，繪制樣品溶液濃度-DPPH自由基清除率曲線，計算半數(shù)清除率IC50值。

1.3.3 綠原酸與蘆丁、槲皮素復(fù)配SR值的測定

將金銀花綠原酸提取液分別與蘆丁、槲皮素按體積比1∶1，1∶3，3∶1，1∶9和9∶1的比例復(fù)配，按照1.3.2小節(jié)測定復(fù)配后混合液DPPH自由基清除率，計算復(fù)配溶液的試驗半數(shù)清除率IC50mix。依據(jù)式（2）計算復(fù)配溶液理論半數(shù)清除率IC50add，分析蘆丁、槲皮素對金銀花綠原酸提取溶液的抗氧化增效作用。采用t檢驗法比較分析復(fù)配溶液的IC50add和IC50mix，確定是否有顯著性差異。若復(fù)配溶液試驗半數(shù)清除率IC50mix＜理論清除率IC50add值，表示兩者間有協(xié)同作用[9,13]。

式中：P1為金銀花綠原酸在復(fù)配組中占的比例；P2為蘆丁或槲皮素在復(fù)配組中占的比例，P2=1-P1；R為綠原酸與蘆丁或槲皮素單獨(dú)作用時的效價比，即R=IC50A/IC50B。

1.3.4 綠原酸、蘆丁、槲皮素之間清除DPPH自由基能力的測定

參考金銀花綠原酸、蘆丁、槲皮素DPPH自由基清除能力，制備質(zhì)量濃度為25 μg/mL三種樣品溶液。將金銀花綠原酸、蘆丁、槲皮素三者按體積比1∶1∶1，1∶3∶1，1∶1∶3，3∶1∶1，1∶3∶3，3∶3∶1和3∶1∶3比例混合均勻，依據(jù)1.3.2小節(jié)測定三者復(fù)配混合液的DPPH自由基清除率，應(yīng)用抗氧化協(xié)同系數(shù)SE值（復(fù)合溶液測定的清除率（ESC）和理論清除率（TSC）之間的比值）分析三者間的協(xié)同抗氧化作用。根據(jù)式（3）計算復(fù)配溶液TSC值，計算不同復(fù)配組合下的抗氧化協(xié)同系數(shù)SE。

式中：ESC1、ESC2、ESC3分別為復(fù)合溶液中綠原酸、蘆丁、槲皮素的試驗清除率。

若抗氧化協(xié)同系數(shù)SE＜1，則表示綠原酸提取物與蘆丁、槲皮素間沒有明顯的協(xié)同作用；若SE＞1，則表示綠原酸提取物與蘆丁、槲皮素間具有協(xié)同作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花綠原酸提取液制備

以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見圖1。線性回歸方程為y=0.049 21x-0.015 7，R2=0.999 0。依據(jù)1.3.1小節(jié)測定金銀花綠原酸提取液中綠原酸的濃度，為2.319 2 mg/mL。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 金銀花綠原酸清除DPPH自由基能力分析

依據(jù)1.3.2小節(jié)，將金銀花綠原酸提取液、蘆丁、槲皮素配制質(zhì)量濃度依次為5，10，20，30，40，50，60，70，80，90和100 μg/mL的樣品溶液，計算出金銀花綠原酸提取液、蘆丁、槲皮素、VC系列樣品溶液SR值、回歸方程、IC50值、R2值，詳見圖2、表1和表2。由圖2可知，4種樣品溶液對DPPH自由基均有較強(qiáng)的清除作用，且其清除能力隨著樣品濃度的增大而增強(qiáng)，但達(dá)到一定濃度后，清除DPPH自由基的能力增長緩慢。由表1可知，金銀花綠原酸對清除DPPH自由基的作用強(qiáng)于蘆丁、VC，弱于槲皮素，說明金銀花綠原酸具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

2.3 綠原酸與蘆丁、槲皮素協(xié)同抗氧化作用研究

2.3.1 金銀花綠原酸與蘆丁協(xié)同清除DPPH自由基能力分析

依據(jù)1.3.2小節(jié)，測定金銀花綠原酸提取液和蘆丁溶液按比例1∶1，1∶3，3∶1，1∶9和9∶1復(fù)配時的DPPH自由基清除率，并計算復(fù)配溶液IC50add，分析金銀花綠原酸與蘆丁協(xié)同清除DPPH自由基能力。由圖3可知，綠原酸、蘆丁復(fù)配溶液的試驗半數(shù)清除率IC50mix＜理論清除率IC50add，表明兩者間具有協(xié)同抗氧化作用。對比表2不同復(fù)配比例金銀花綠原酸、蘆丁混合液的IC50值，當(dāng)復(fù)配比例為9∶1時，DPPH自由基半數(shù)清除率為27.97%，協(xié)同清除DPPH自由基的效果較好。

2.3.2 金銀花綠原酸與槲皮素協(xié)同清除DPPH自由基能力分析

圖2 綠原酸、蘆丁、槲皮素、VC清除DPPH自由基能力

表1 綠原酸、蘆丁、槲皮素、VC回歸方程與半數(shù)清除率

表2 綠原酸與蘆丁復(fù)配溶液抗氧化性回歸方程與半數(shù)清除率

圖3 綠原酸與蘆丁復(fù)配混合液協(xié)同抗氧化分析

依據(jù)1.3.2小節(jié)，測定金銀花綠原酸提取液和槲皮素溶液按比例1∶1，1∶3，3∶1，1∶9和9∶1復(fù)配時的DPPH自由基清除率，并計算復(fù)配溶液IC50add，分析金銀花綠原酸與槲皮素協(xié)同清除DPPH自由基能力。由圖4可知，綠原酸、槲皮素復(fù)配溶液的試驗半數(shù)清除率IC50mix＜理論清除率IC50add，表明兩者間具有協(xié)同抗氧化作用。對比表3不同比例金銀花綠原酸、槲皮素混合液的IC50值，當(dāng)復(fù)配比例為1∶9時，DPPH自由基半數(shù)清除率為17.76%，協(xié)同清除DPPH自由基的效果較好。

圖4 綠原酸與槲皮素復(fù)配溶液抗氧化能力分析

表3 金銀花綠原酸與槲皮素不同復(fù)配比例回歸方程與半數(shù)清除率

2.3.3 綠原酸、蘆丁、槲皮素協(xié)同清除DPPH自由基能力分析

依據(jù)1.3.2小節(jié)，測定金銀花綠原酸提取液、蘆丁、槲皮素溶液比例1∶1∶1，1∶3∶1，1∶1∶3，3∶1∶1，1∶3∶3，3∶3∶1和3∶1∶3復(fù)配時的DPPH自由基清除率，分析蘆丁、槲皮素對金銀花綠原酸抗氧化性的協(xié)同作用。由圖5可知，當(dāng)金銀花綠原酸、蘆丁、槲皮素復(fù)配比例為1∶3∶3時，SE值為1.20，三者間協(xié)同清除DPPH自由基的效果較好。

圖5 槲皮素、蘆丁、綠原酸混合液抗氧化能力分析

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取金銀花中的綠原酸，分析蘆丁、槲皮素對金銀花綠原酸抗氧化增效作用。金銀花綠原酸、蘆丁、槲皮素清除DPPH自由基能力隨著抗氧化物質(zhì)濃度的增加而增大，其IC50值分別為33.80%，45.38%和26.77%。通過對比3種抗氧化劑的IC50值可知，對DPPH自由基的清除能力大小依次為：金銀花綠原酸抗氧化效果強(qiáng)于蘆丁，弱于槲皮素。將金銀花綠原酸分別于蘆丁、槲皮素按不同比例進(jìn)行復(fù)配，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆丁、槲皮素對綠原酸的抗氧化能力具有協(xié)同增效作用。當(dāng)綠原酸與蘆丁復(fù)配比例為9∶1時，復(fù)配混合液的IC50值為27.97%；當(dāng)綠原酸與槲皮素復(fù)配比例為1∶9時，復(fù)配混合液的IC50值為25.99%，清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)。將金銀花綠原酸、蘆丁、槲皮素按固定比例1∶1∶1，1∶3∶1，1∶1∶3，3∶1∶1，1∶3∶3，3∶3∶1和3∶1∶3進(jìn)行復(fù)配，當(dāng)復(fù)配比例為3∶3∶1時，清除率最高為77.57%，且SE值為1.20，表明槲皮素、蘆丁對金銀花綠原酸具有較好的抗氧化協(xié)同增效作用。