大鼠多器官彗星試驗方法的驗證研究

周長慧，韓天嬌，黃鵬程，馬 璟，常 艷

(中國醫藥工業研究總院/上海益諾思生物技術股份有限公司，上海 201203)

體內彗星試驗近幾年來受到廣泛關注，國際上多個監管機構如食品化學誘變委員會、美國食品藥品監督管理局藥品評價和研究中心、歐洲食品安全局、人用藥品注冊技術要求國際協調會和歐洲醫藥管理局推薦應用體內彗星試驗對體內或體外遺傳毒性試驗結果進行追加補充。其中人用藥品注冊技術要求國際協調會議(International Council for Harmonization，ICH)已于2011年將體內肝臟彗星試驗列入S2R1指導原則中，將其作為體內試驗第2個首選終點[1]。但一項試驗投入正式應用之前需要經過大量的驗證，因此2006年由日本替代方法驗證中心牽頭，與美國國家替代毒性試驗方法評價中心、歐洲替代方法驗證中心和日本環境誘變劑學會/哺乳動物致突變性研究組共同組織彗星試驗的聯合驗證，該驗證的成功完成為制定標準的試驗方案和OECD試驗指導原則打下了基礎[2]。2014年OECD體內堿性彗星試驗指導原則TG489發表[3]。

彗星試驗具有如下優點[4]：①該試驗測定的是單個細胞水平的DNA損傷，故敏感性相對較高；能夠測定多種感興趣的組織或器官的遺傳毒性[5-7]；②進行分析所需的細胞數目相對較少；③檢測譜較寬，能夠測定如DNA單鏈斷裂、DNA雙鏈斷裂及堿性不穩定位點等在內的DNA損傷[8]；④試驗的數據結果采集可在試驗結束隔日進行，數據的收集過程較短；⑤該試驗耗時相對較短，并且試驗成本相對較低。

相比國外對體內彗星試驗的廣泛研究，國內對該項試驗的標準化研究相對較少。本研究旨在采用多個不同作用機制的化合物(1個遺傳毒性化合物對氯苯胺、1個非遺傳毒性化合物氯化鈉、1個肝毒性化合物對乙酰氨基酚、1個腎毒性化合物慶大霉素)驗證本實驗室前期建立的大鼠體內多器官(肝、胃和腎)的堿性彗星試驗方法[9]，研究靶器官毒性化合物因細胞毒性可能對彗星試驗結果的影響，擬為國內多個GLP實驗室對該方法的聯合驗證提供技術支撐，也有望為該方法在新藥遺傳毒性評價領域的推廣提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

對氯苯胺、氯化鈉、對乙酰氨基酚、甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate，EMS)，均購于Sigma公司；慶大霉素，購于國藥集團化學試劑有限公司。Comet Assay?試劑盒、電泳儀，均購于美國Trevigen公司，SYBR?Gold染液購自加拿大Invitrogen公司，40μm孔徑微孔濾膜為美國BD Falcon；X51型顯微鏡購自Olympus公司。

1.2 動物、分組處理和取材

每個受試物使用SPF級雄性SD大鼠25只，7～9周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。在溫度20～26℃、濕度40%～70%、12 h/12 h明暗周期的飼養室，每籠飼養5只大鼠，用SPF大小鼠維持飼料，自由進食和飲水。每天給予受試物之前，EMS采用生理鹽水稀釋至20 mg/mL，慶大霉素采用生理鹽水稀釋至80、40和20 mg/mL，氯化鈉采用去離子水配制成至50、100和200 mg/mL，對乙酰氨基酚采用0.5%CMC-Na重懸至2、10和50 mg/mL，對氯苯胺采用玉米油重懸至3.75、7.5和15 mg/mL。除慶大霉素肌肉注射外，其他均經口灌胃給予受試物，體積為10 mL/kg。

每個受試物的實驗動物適應1周后，隨機分成5組，每組5只動物，分別為陰性對照組、陽性對照組和低、中、高劑量受試物組。受試物和溶劑對照品分別在第1天、第2天(約24 h后)和第3天(約21 h后)給予動物，陽性對照品(EMS)僅給藥2 d(第2和第3天)。每天給予受試物前稱體質量，在最后一次給予受試物約3 h后，動物經戊巴比妥鈉(30～45 mg/kg)麻醉放血安樂死后進行肝臟、胃和腎臟的組織取樣。

1.3 單細胞懸液制備和制片

將胃沿胃大彎剪開，用冷的無鈣鎂的PBS清洗胃部；用冷的剪切緩沖液[將20 mmol/L EDTA-Na2溶于一定量的Hank’s緩沖液(無鈣、鎂和苯酚)中，待充分溶解后，應用5 mol/L氫氧化鈉溶液和6 mol/L鹽酸溶液將溶液pH值調至7.5，并將溶液置于2～8℃冰箱中保存以備用，在用前加入10%DMSO]清洗胃，棄去前胃部分，腺胃浸于現配冷的剪切緩沖液15～30 min；胃表面上皮用塑料刮板刮幾次后用冷的剪切緩沖液充分沖洗；用不銹鋼輕輕刮胃黏膜5～10次以釋放細胞；用3 mL剪切緩沖液將刮下的細胞制成單細胞懸液，輕輕吹打約15次，經40μm濾膜過篩得上清液用于制片。

取每只動物的肝左葉中間部分，用冷的剪切緩沖液沖洗，其中僅對乙酰氨基酚實驗中剩下的肝左葉部分用10%福爾馬林固定用于病理檢查。取每只動物的一個腎臟進行彗星試驗，先將腎臟表面一層膜棄去，沿皮質大彎中心處剪掉約5 mm3的組織。其中僅慶大霉素實驗中彗星取材剩余的腎臟和另一個腎臟將用10%的福爾馬林固定用于病理檢查。取下的新鮮肝組織和腎臟用剪刀剪碎以釋放細胞，經40μm濾膜過篩得上清液用于制片。

用冷的剪切緩沖液將肝、胃和腎細胞濃度調至(2.0～4.0)×105個/mL。取上述制備好的肝臟單細胞懸液與0.5%低熔點膠混合加樣于彗星玻片的孔中。每只動物至少平行制片2孔，同一動物的平行樣品不在同一張玻片上。

1.4 裂解、解旋、電泳和分析

將制備完成的玻片浸入裂解液中，置于2～8℃冰箱避光過夜裂解。然后將其置于堿性解旋液中解旋后，采用Trevigen電泳系統進行電泳(保持電泳的電壓為0.7 V/cm，電流約為300 mA)。電泳后，玻片經中和、干燥后室溫保存待分析。玻片經SYBR Gold?染液染色后，采用連接彗星顯像分析系統(Comet Assay IV)的熒光顯微鏡閱片分析。每只動物分析150個細胞(即每孔75個細胞)的尾部DNA百分率，并記錄期間的刺猬細胞(頭小、尾巴大、分布松散的細胞)數目。

1.5 數據分析

計數參與彗星試驗的動物肝、胃和腎細胞每孔尾部DNA百分率的中位數和平均數，并計算每只動物兩孔或多孔尾部DNA百分率的中位數和平均數的均值，結果以表示。

受試物各劑量組的尾部DNA百分率均分別與各自溶劑對照組的尾部DNA百分率性別區分進行統計分析比較，采用如下方法進行統計：①用Levene's檢驗檢測數據的方差齊性，如方差齊，則進行單因素方差分析(ANOVA)；當方差不齊，則采用Dunnett T3檢驗進行組間比較(0.05和0.01水平)。②當方差分析結果有統計學意義，則進一步用Dunnett t檢驗進行組間比較；當方差分析結果無統計學意義，則統計結束。陽性對照組的尾部DNA百分率與溶劑對照組的尾部DNA百分率性別區分比較采用獨立樣本t檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 一般情況觀察

實驗過程中未見死亡或瀕死動物。對氯苯胺≥37.5 mg/kg劑量組動物出現四肢顏色發暗發涼；≥75 mg/kg劑量組動物還可見眼周分泌污染物；150 mg/kg劑量組動物的活動度減少。對乙酰氨基酚500 mg/kg組個別動物出現活動度減少外，其余動物均未見其他明顯異常。氯化鈉和慶大霉素各劑量組動物未見明顯異常的臨床癥狀。

2.2 組織病理學檢查

本研究對肝毒性化合物對乙酰氨基酚處理組動物的肝臟和腎毒性化合物慶大霉素處理組動物的腎臟進行了病理結果分析。其中，對乙酰氨基酚20 mg/kg處理組有1只動物肝臟出現輕微的單細胞炎癥反應；100 mg/kg處理組有2只動物出現輕度局灶性炎癥、單細胞壞死；500 mg/kg處理組有4只動物肝臟出現單細胞炎癥、壞死腫脹等病理變化。圖1和圖2分別為100和500 mg/kg對乙酰氨基酚引起的肝臟病理變化。慶大霉素由于劑型限制，在最大可行處理劑量80 mg/kg水平下腎臟組織病理學未見改變。

圖1 100 mg/kg對乙酰氨基酚處理組大鼠的肝臟組織病理學改變

圖2 500 mg/kg對乙酰氨基酚處理組大鼠的肝臟組織病理學改變

2.3 彗星試驗結果

對氯苯胺37.5 mg/kg組動物肝、胃和腎的尾部DNA百分率均值(即中位數的均值)與溶劑對照組相比差異無統計學意義(P均＞0.05)，75和150 mg/kg組產生的尾部DNA百分率均值與溶劑對照組相比均增加(P＜0.05)，見表1。

氯化鈉的劑量高至2 000 mg/kg，其肝、胃和腎的尾部DNA百分率均值與溶劑對照組相比差異亦無統計學意義(P均＞0.05)，見表2。

對乙酰氨基酚的3個劑量組與溶劑對照組相比，大鼠肝、胃和腎的尾部DNA百分率均未出現顯著性增加，但中劑量(100 mg/kg)組動物的胃和腎臟分別出現1個和4個刺猬細胞，高劑量(500 mg/kg)組動物肝臟、胃和腎臟分別出現了4個、1個和7個刺猬細胞；陽性對照EMS組大鼠肝臟、胃和腎臟分別出現了5、13和10個刺猬細胞，見表3。

表1 對氯苯胺處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率(%，)

表1 對氯苯胺處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率(%，)

與溶劑對照組相比，*P＜0.01.

組別溶劑對照組對氯苯胺37.5 mg/kg 75 mg/kg 150 mg/kg陽性對照組(EMS)肝0.31±0.56 2.28±1.82 11.38±2.19*13.45±2.82*16.65±1.51*胃0.68±0.36 2.4±1.93 10.3±7.84*11.5±3.26*22.10±2.55*腎1.17±0.63 1.18±1.71 10.11±4.54*14.23±6.48*22.17±4.01*?

表2 氯化鈉處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率(%，)

表2 氯化鈉處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率(%，)

與溶劑對照組相比，*P＜0.01.

組別溶劑對照組氯化鈉500 mg/kg 1 000 mg/kg 2 000 mg/kg陽性對照組(EMS)肝0.92±0.64 0.09±0.05 0.33±0.37 0.14±0.19 13.25±1.75*胃0.92±0.61 0.72±0.41 0.35±0.31 0.79±0.39 18.46±0.39*腎0.39±0.27 0.21±0.21 0.86±0.77 0.46±0.28 11.62±1.64*

表3 對乙酰氨基酚處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率和刺猬細胞數

慶大霉素的3個劑量組與溶劑對照組相比，肝、胃和腎的尾部DNA百分率差異無統計學意義(P均＞0.05)，見表4。

表4 慶大霉素處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率(%，)

表4 慶大霉素處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率(%，)

與溶劑對照組相比，*P＜0.01.

3 討論

對氯苯胺的Ames試驗和體外染色體斷裂試驗呈陽性，小鼠體內微核試驗呈陽性且小鼠多個靶器官的彗星試驗結果也呈陽性[10]，因此應用對氯苯胺進行大鼠體內彗星試驗的驗證。對氯苯胺的彗星試驗結果與預期相符，灌胃給予受試物3次，75和150 mg/kg處理組大鼠肝臟、胃的尾部DNA百分率與陰性對照組相比明顯增加，該試驗結果與國際聯合驗證結果相符[11]；75和150 mg/kg處理組大鼠腎臟尾部DNA百分率與陰性對照組相比明顯增加，且無該化合物腎臟靶器官的相關報道。因此，對氯苯胺的大鼠體內堿性彗星試驗結果呈陽性。

氯化鈉是已知的非遺傳毒性化合物，常作為試驗溶劑。本試驗中，參考聯合驗證的劑量(2 000、1 000和500 mg/kg)，結果顯示3個劑量組的尾部DNA百分率與陰性對照組相比差異均無統計學意義，該結果與彗星聯合驗證結果一致。因此，氯化鈉的彗星試驗結果呈陰性。

刺猬細胞是在形態上“頭很小但尾巴很大分布很散”的細胞[12]，目前國際上對刺猬細胞作為遺傳毒性或細胞毒性的標志出現分歧，當試驗結果中出現了刺猬細胞或彗星試驗結果呈陽性時需要判斷是否細胞毒性對彗星試驗結果產生影響。因為具有特定靶器官毒性化合物的細胞毒性可能對彗星試驗結果評判有影響，IWGT建議應采用評價細胞毒性的金標準——病理檢查進行排除[13-14]。

對乙酰氨基酚是已知的肝毒性化合物，文獻報道[15]對乙酰氨基酚在625 mg/kg劑量水平下，作用6和12 h后，大鼠出現明顯的肝臟組織病理學改變，故本課題乙酰氨基酚的低、中和高劑量分別設置為20、100和500 mg/kg。具有肝臟毒性的對乙酰氨基酚各劑量組均出現了刺猬細胞，病理結果顯示100和500 mg/kg劑量組都出現了不同程度的肝臟細胞炎癥反應及細胞壞死等變化。但對乙酰氨基酚各個劑量3個組織器官的尾部DNA百分率與陰性對照相比差異均無統計學意義，因此在乙酰氨基酚的彗星試驗結果呈陰性。

由于劑型的限制，慶大霉素注射液的最大劑量為80 mg/kg，有文獻報道[16]該劑量的慶大霉素在處理7和14 d，大鼠腎臟出現明顯的病理改變(如明顯局灶性腎小管上皮細胞變性壞死、局灶性腎小管嗜堿性變、不同程度眼形細胞浸潤和局灶性腎小管擴張等)。但在該劑量下，肌肉注射慶大霉素3 d，腎臟病理學沒有改變；慶大霉素20、40和80 mg/kg各劑量組尾部DNA百分率與陰性對照組相比并無顯著性增加，因此在本試驗條件下慶大霉素注射液的彗星試驗呈陰性。

考慮到這4種化合物的組織特異性和作用方式，本研究通過應用不同機制的化合物對體內堿性彗星試驗方法進行了驗證。其中對氯苯胺的彗星結果呈陽性，氯化鈉、對乙酰氨基酚和慶大霉素的彗星結果呈陰性，結果與預期一致，證明了該試驗方法具有較好的靈敏度和特異性。本研究中使用3 d給藥試驗設計可以很容易地將細胞遺傳學損傷和DNA損傷終點整合到一項研究中。與國際彗星試驗聯合驗證相比，增加了腎臟DNA損傷的評價，并研究化合物產生靶器官毒性的同時是否能夠引起DNA損傷，可為國內機構的聯合驗證提供技術支持。綜上所述，體內多器官彗星檢測是檢測一系列DNA損傷劑的有效方法，具有廣泛的適用性。