天麻鉤藤飲多糖的提取與分離純化研究

張 鑫，安加文，王文佳，劉思海，蔡遠俊，王珊珊，梁建東

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025)

天麻鉤藤飲由天麻、鉤藤、石決明(生)、山梔、黃芩、川牛膝、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、茯苓組成，具有平肝熄風、清熱瀉火、益腎活血的功效，可治療高脂血癥、高血壓、腦出血、偏頭痛、內耳性眩暈等疾病[1-2]。現代藥理研究表明，天麻鉤藤飲具有提高機體抗氧化能力，降低血壓，抑制心肌重構等作用[3]。天麻鉤藤飲發揮降血脂、抗氧化性的藥效物質基礎尚不明確，但組方藥物中多含有多糖類物質。植物多糖具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗衰老、抗腫瘤等作用[4-5]。目前對中醫方劑中多糖的研究已成為熱點，故本實驗對天麻鉤藤飲中的多糖進行提取與分離純化研究，為天麻鉤藤飲及天麻鉤藤飲多糖的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

1510酶標儀(Thermo Fisher Scientific)，TD5A-WS離心機(湖南湘立科學儀器有限公司)，PL303分析天平(梅特勒上海有限公司)，HZQ-QB搖床(蘇州威爾實驗用品有限公司)，電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，移液槍(大龍興創實驗儀器(北京)有限公司)。

1.2 材料與試劑

1.2.1 試劑 考馬斯亮藍G-250(北京索萊寶科技有限公司，批號：20190315)、牛血清蛋白(愛必信上海生物科技有限公司，批號：JB25)、葡萄糖(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20180530)、無水乙醇(重慶川東化工有限公司，批號：20190101)、磷酸(天津市恒興化學試劑制造有限公司，批號：20161006)、苯酚(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20171020)、濃硫酸(重慶川東化工有限公司，批號：20160501)、木瓜蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司，批號：122E021)、鹽酸(重慶川東化工有限公司，批號：20190101)。以上所有試劑均為分析純。蒸餾水(自制)。葡萄糖凝膠G-100(北京索萊寶科技有限公司，批號：20180709)。

1.2.2 材料 天麻、鉤藤、石決明(生)、山梔、黃芩、川牛膝、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、朱茯苓，均購買自貴州一品藥業連鎖有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標準曲線的繪制 精密稱取25 mg葡萄糖至25 mL量瓶中，蒸餾水溶解并定容，搖勻，配得1 mg/mL葡萄糖溶液。精密吸取該葡萄糖溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL于25 mL量瓶中，蒸餾水定容。精密吸取各濃度葡萄糖溶液1.0 mL于干燥試管中，加入1.0 mL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速加入6 mL濃硫酸，搖勻，冷卻后于490 nm波長處測量其吸光度，以葡萄糖質量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 天麻鉤藤飲粗多糖提取條件優化 分別稱取天麻、山梔、黃芩、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、朱茯苓各9 g，鉤藤、川牛膝各12 g，生石決明18 g，于燒杯中加水浸泡30 min，再進行煎煮，微沸保持一定時間，煎煮數次，每次加入一定比例水，合并藥液，濃縮至適量，加入4倍量無水乙醇，醇沉12 h，離心(4 000 r/5 min)，沉淀干燥即得粗多糖[6]。

(1)料液比。本實驗采用煎煮法，故不考慮溫度的影響。稱取3組復方藥物量，分別加入15倍水、20倍水、30倍水煎煮30 min，煎煮完后倒出藥液，重新加入15、20、30倍蒸餾水，煎煮3次，合并藥液，濃縮至適量，加入4倍量無水乙醇，醇沉12 h，離心，沉淀干燥得粗多糖。

(2)煎煮時間。稱取4組天麻鉤藤飲藥物量，加入20倍蒸餾水煎煮，4組藥物分別煎煮20 min、30 min、40 min、50 min，每次煎煮完后倒出藥液，重新加入20倍水，煎煮3次，合并藥液，濃縮至適量，加入4倍量無水乙醇，醇沉12 h，離心，沉淀干燥得粗多糖。

(3)煎煮次數。稱取4組天麻鉤藤飲藥物量，加入20倍蒸餾水煎煮，將4組藥物分別煎煮2、3、4、5次，每次煎煮30 min，每次煎煮完后倒出藥液，重新加入20倍水，合并藥液，濃縮至適量，加入4倍量無水乙醇，醇沉12 h，離心，沉淀干燥得粗多糖。

1.3.3 純化粗多糖(酶法去除蛋白質) 稱定500 mg天麻鉤藤飲粗多糖，分別溶于500 mL蒸餾水中，待其充分溶解后，備用。

(1)酶用量。取6組粗多糖，分別加入0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的木瓜蛋白酶，搖勻，于50 ℃下水浴40 min后，置沸水中水浴5 min，冷卻后測其吸光度。

(2)酶解時間。取5組粗多糖，加入0.8%木瓜蛋白酶，搖勻，分別于50 ℃下水浴酶解20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，酶解完成后置于沸水中水浴5 min，冷卻后測其吸光度。

(3)酶解溫度。取8組粗多糖，加入0.8%木瓜蛋白酶，搖勻，分別于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃溫度下酶解40 min。酶解完成后置于沸水中水浴5 min，冷卻后測其吸光度。

(4)酶解pH。取8組粗多糖，加入0.8%木瓜蛋白酶，搖勻，調節pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11，于50 ℃下水浴酶解40 min后，置沸水中水浴5 min，冷卻后測其吸光度。

1.3.4 分離純化后多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法進行測定[7]。

1.3.5 分離純化后蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法進行測定[8]。

1.3.6 粗多糖的分離 將天麻鉤藤飲粗多糖配制成1 mg/mL的溶液，通過SephadexG-100層析柱進行分離，以蒸餾水為洗脫液，流速為0.8 mL/min，每隔5 min收集一次(每管4 mL)。共收集180管，分別從每管中取200 μL收集液，使用苯酚硫酸法于490 nm下測其吸光度，繪制洗脫曲線。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

以葡萄糖質量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，y=14.229x-0.0001，r=0.999，見圖1，結果表明在0.02～0.1 mg范圍內，葡萄糖的質量與吸光度呈良好的線性關系。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 天麻鉤藤飲粗多糖提取條件優化

2.2.1 料液比 由圖2知，隨著煎煮料液比增加，粗多糖質量在料液比1∶15～1∶20之間增加，隨后降低。在1∶20時，粗多糖質量最高，達10.65 g。

圖2 料液比對粗多糖質量的影響

2.2.2 煎煮時間 由圖3可知，隨著煎煮時間的增加，粗多糖質量先增加，煎煮40 min時粗多糖質量最高，達10.95 g。當煎煮時間為50 min時，粗多糖質量明顯降低。

圖3 煎煮時間對粗多糖質量的影響

2.2.3 煎煮次數 由圖4知，隨著煎煮次數的增加，粗多糖質量先增加，煎煮4次時粗多糖質量最高，達11.2 g，4次后粗多糖質量減少。

圖4 煎煮次數對粗多糖質量的影響

2.3 純化粗多糖(酶法去除蛋白質)

2.3.1 酶用量 由圖5可知，當加入的木瓜蛋白酶量為0.8%時，蛋白質的去除率最高，而多糖的剩余率也最高，故最佳酶用量為0.8%。

圖5 酶用量對酶法脫蛋白效果的影響

2.3.2 酶解時間 由圖6可知，當酶解時間為60 min時蛋白質的去除率略高于酶解50 min時的蛋白質去除率，但在50 min時的多糖剩余率要略高于酶解時間為60 min時的多糖剩余率，研究時主要考慮減少多糖的損耗，綜合考慮，最佳酶解時間為40 min。

2.3.3 酶解溫度 由圖7可知，溫度差別對于多糖的損耗影響不大，而在50 ℃時蛋白質的去除率最高，綜合考慮，最佳酶解溫度為50 ℃。

2.3.4 酶解pH 由圖8可知，pH對酶的影響較大，當pH為中性時蛋白質的去除率較高且多糖的損耗較小，綜合考慮，酶解最佳pH=7。

圖6 酶解時間對酶法脫蛋白的效果影響

圖7 酶解溫度對酶法脫蛋白效果的影響

圖8 pH對酶法脫蛋白效果的影響

2.4 多糖的分離

由圖9可知，吸光度在0.15以上的峰有9個，初步從粗多糖中分離得到9種不同組分。

圖9 SephadexG-100柱層析分離粗多糖洗脫曲線

3 討論

多糖是天麻鉤藤飲中多數藥物的主要成分之一，充分提取和純化多糖是開發利用天麻鉤藤飲的關鍵。本文通過單因素實驗對天麻鉤藤飲中多糖的提取及分離純化進行優化。結果表明，最佳提取工藝為煎煮4次，每次以1∶20的料液比煎煮40 min，此工藝下得到的粗多糖質量最高。酶法去除蛋白質的最佳工藝為加入0.8%的木瓜蛋白酶，pH=7，在50 ℃下反應40 min，此工藝下蛋白質的去除率最高，且多糖的損耗較少。本實驗的煎煮液中總糖的含量為77.78%。對多糖的提取和純化工藝進行優化，可保證在實驗時得到最大量的粗多糖，可為后續實驗提供足夠的原料，避免成本的損耗。吸光度在0.15以上的峰有9個，初步從粗多糖中分離得到9種不同組分。本實驗對復方中的多糖進行了提取分離純化，為今后天麻鉤藤飲及天麻鉤藤飲中多糖成分的開發利用提供依據。