芹菜素對人肝癌HepG2細胞糖酵解的影響及體內實驗研究

張 睿，陳瑞妮，李 偉

(1.江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫藥大學 醫學院·整合醫學學院，江蘇 南京 210023；3.南京中醫藥大學 中醫學院·中西醫結合學院，江蘇 南京 210023)

芹菜素(4′，5，7-三羥基黃酮；apigenin，API)又稱芹黃素、洋芹素，是天然存在的黃酮類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜(如芹菜)、茶葉和香料中[1]。許多中藥中含有大量芹菜素，如藜蘆、紫蘇、虎杖、蕪花、半枝蓮、仙鶴草等[2]。大量實驗研究表明，芹菜素具有抗炎、抗癌、抗氧化、調節內分泌等多方面的生物活性[3]。芹菜素對多種人類腫瘤細胞具有細胞毒性作用，包括乳腺癌、結腸癌、肺癌等[4]。研究證實，芹菜素通過誘導凋亡及誘導周期阻滯于G2/M期而抑制肝癌細胞的生長[5]。即便是在有氧環境中，腫瘤細胞仍然偏好通過糖酵解途徑提供能量并生成乳酸，但芹菜素對人肝癌細胞糖酵解的作用研究較少。

本研究選用人肝癌HepG2細胞[6]，體外研究芹菜素對肝癌細胞增殖、糖酵解及相關蛋白的作用，探討其作用機制，再利用裸小鼠移植瘤模型考察芹菜素的體內作用。本研究針對芹菜素對人肝癌細胞糖酵解的影響及可能的機制進行探究，從而驗證芹菜素抗腫瘤活性，也為中醫臨床腫瘤防治時芹菜素的應用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

芹菜素(Apigenin)，純度≥97%，購自美國Sigma公司。實驗前，芹菜素用DMSO溶解，培養基稀釋至所需濃度，DMSO終濃度≤0.1%。

1.2 動物與細胞

SPF級BALB/c小鼠，購自常州卡文斯實驗動物有限公司(實驗動物生產許可證：SCXK(蘇)2011-0003)。日齡：35～40 d；體重：18～22 g；性別：雄性。

人肝癌HepG2細胞，購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學細胞庫。細胞貼壁生長，用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養。

1.3 試劑

溴脫氧尿核苷(BrdU)購自美國Sigma公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；葡萄糖攝取檢測試劑盒購自Invitrogen公司；乳酸生成檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；PDHK1、HKⅡ、LDHA、HIF-1α購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體購自武漢Boster公司；IRDyeTM800 Conjugated anti-mouse/rabbit second antibody購于美國 Rockland公司；蘇木素購自碧云天公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒：購自南京凱基生物公司。

1.4 儀器

HERA cell 150i CO2培養箱、MSC-Advantage 1.2生物安全柜(美國Thermo electron公司)；DFC450 C型倒置顯微鏡(德國Leica公司)；Centrifuge 5415R型冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；MATRIX Cell Mate II型精密移液器(美國Thermo公司)；FV10-MCPSU型激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus)；Mini-PROTEAN 3型電泳裝置(美國Bio-Rad公司)。

1.5 方法

1.5.1 細胞培養 人肝癌細胞HepG2以適量濃度接種于培養瓶中，加入含10% 胎牛血清的DMEM培養液，置于37 ℃恒溫及飽和濕度的培養箱中培養，培養條件為：37 ℃，20%O2，5% CO2和75% N2。細胞呈貼壁生長。每2～3 d傳代一次，傳代時用0.02% EDTA，0.25% 胰酶消化2～3 min，棄去消化液，加入新培養液吹打均勻，按所需細胞量移入新培養瓶，添加完全培養液至適量。

1.5.2 檢測摻入BrdU的細胞比例 將HepG2細胞種入使用100 μg· L-1多聚賴氨酸包被過的蓋玻片于6孔板中進行細胞爬片，待到細胞長到70%～80% 時分別給予不同濃度的芹菜素或等體積的DMSO，使終濃度為2，4，8 μmol·L-1。培養24 h后將BrdU加入細胞培養基中，終質量濃度是30 mg·L-1，繼續培養30 min后，進行抗BrdU免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下隨機拍攝上下左右中共5個視野。結果以BrdU+細胞百分比衡量。BrdU陽性細胞比= BrdU陽性細胞數/總細胞數×100%，對照組定義為100%，取這5個視野中的平均值統計分析。

1.5.3 Annexin V-FITC/PI雙染 在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內側翻向外側。AnnexinV是一種分子量為35～36 kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此，Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V進行熒光素(EGFP、FITC)標記，以標記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此，將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。人肝癌HepG2細胞接種于6孔板中，密度為1×105個/mL。芹菜素處理后，分別置于常氧/缺氧條件下培養24 h。收集細胞，洗滌。將上述細胞懸液離心棄上清，依Annexin-V/PI雙染試劑盒操作：將細胞數調整到(2～5)×105個/mL，用結合緩沖液500 μL 中重新懸浮細胞，加入5 μL Annexin-V染液，混勻并離心，再加入5 μL PI染液，混勻并離心，避光孵育15 min，于流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.5.4 分析細胞糖酵解水平及相關蛋白表達 HepG2細胞經終濃度為20、40、80 μmol/L的芹菜素或等體積DMSO處理24 h，收集細胞后，用葡萄糖攝取檢測試劑盒和乳酸生成檢測試劑盒分析HepG2細胞中糖酵解水平。HepG2細胞經終濃度為20、40、80 μmol/L的芹菜素或等體積DMSO處理24 h，收集細胞并提取蛋白，進行免疫印跡分析。

1.5.5 EMSA檢測細胞中HIF-1α與DNA結合能力 電泳遷移實驗(EMSA)反應液由以下成分組成：①8 μg的按實驗所需條件處理的HepG2細胞的核蛋白；②20 μL的結合緩沖液；③1 μL的生物素標記的寡核苷酸探針(0.2 μmol/L)：HIF-1α(5′-TCT GTA CGT GAC CAC ACT CAC CTC-3′，3′-AGA CAT GCA CTG GTG TGA GTG GAG-5′)，脫氧核糖核苷酸生物素標記末端的共識寡核苷酸探針；④野生型的未標記的 HIF-1α探針(10 μmol/L)；⑤突變型的未標記的HIF-1α探針(1.75 μmol/L)：HIF-1α(5′-TCT GTA AAA GAC CAC ACT CAC CTC-3′，3′-AGA CAT TTT CTG GTG TGA GTG GAG-5′)；⑥Stat3 抗體。電泳遷移混合液室溫放置20 min，加入5 μL的上樣緩沖液，DNA-蛋白復合物，在0.5×Tris-硼酸鹽-EDTA緩沖液中，經6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳380 mA，1 h后，轉移到帶正電荷的硝酸纖維素膜，并經紫外交聯。最后，使用化學發光電泳遷移工具包，通過Bio-Rad紅外系統使凝膠轉移可視化。

1.5.6 裸鼠移植瘤實驗 取對數生長期的HepG2細胞，以0.1 mL(2×106個)接種于裸鼠右側腋窩皮下。用游標卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至50～100 mm3后將動物隨機分組，每組6只。設4個組別，分別為生理鹽水對照組、芹菜素100 mg/kg組、芹菜素200 mg/kg組、芹菜素400 mg/kg組。芹菜素腹腔注射隔天給藥，30 d后，裸鼠處死，手術剝取瘤塊并比較分析各組瘤體積和瘤重。抑瘤率(tumor inhibitory ratio)的計算公式為：

抑瘤率% =(1-給藥組平均瘤重/空白組平均瘤重)×100%

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 芹菜素對HepG2細胞增殖和凋亡的影響

對各組中BrdU陽性的HepG2細胞和DAPI陽性的總細胞計數。如圖1所示，與對照組比較，芹菜素給藥組BrdU陽性的數目比例顯著減少，40 μmol/L處理組與對照組相比其差異具有統計學意義(P<0.05)，80 μmol/L處理組與對照組相比差異具有顯著性(P<0.01)，表明芹菜素在體外可以劑量依賴性地抑制HepG2細胞的增殖。Annexin V-FITC/PI雙染結果顯示，80 μmol/L芹菜素處理組HepG2細胞凋亡率為41.3%，20 μmol/L和40 μmol/L芹菜素對HepG2細胞的凋亡誘導作用較弱。

注：*P<0.05，**P <0.01。

2.2 芹菜素對HepG2細胞糖酵解作用的影響

腫瘤細胞的代謝有一個顯著的特點，即高水平的糖酵解作用。檢測各組HepG2細胞內葡萄糖攝取和乳酸生成水平。結果如圖2所示，與對照組比較，芹菜素給藥組內HepG2細胞的葡萄糖攝取和乳酸生成水平均有所下降，40 μmol/L處理組與對照組相比其差異具有統計學意義(P<0.05)，80 μmol/L處理組與對照組相比差異具有顯著性(P<0.01)，表明芹菜素在體外可以劑量依賴性地抑制HepG2細胞的糖酵解作用。

注：*P <0.05，**P <0.01。

2.3 芹菜素對HepG2細胞內HIF-1α及糖酵解相關蛋白表達的影響

HIF-1α上調多種糖酵解的因素，包括HKII和LDHA。同時，HIF-1α通過抑制丙酮酸脫氫酶來抑制丙酮酸進入線粒體，從而導致三羧酸循環受到抑制，這一過程需要PDHK1的誘導。Western blot檢測結果表明，芹菜素可以降低HepG2細胞內糖酵解相關蛋白(PDHK1、HKII和LDHA)的表達，同時下調HIF-1α的表達(見圖3)，其中，80 μmol/L作用效果非常明顯(P<0.01)，提示芹菜素可抑制HepG2細胞內糖酵解。

圖3 芹菜素對HepG2細胞糖酵解相關蛋白的影響

2.4 芹菜素對HIF-1α與DNA結合能力的影響

EMSA的結果(見圖4)顯示，芹菜素對HIF-1α與DNA的結合能力也有明顯的抑制作用。從40 μmol/L開始表現出很好的效應，加藥組與對照組相比具有顯著性差異(P<0.01)，以上結果表明芹菜素通過調節HIF-1α的表達及其與DNA結合能力發揮抗腫瘤作用。

2.5 芹菜素對HepG2細胞裸鼠移植瘤的影響

裸鼠移植瘤實驗結果表明(見圖5、圖6)，芹菜素在體內有著較好的抑瘤作用，芹菜素100 mg/kg組瘤體積的相對增殖率為86.09%，抑瘤率為22.33%；芹菜素200 mg/kg組瘤體積的相對增殖率為75.97%，抑瘤率為37.32%；芹菜素400 mg/kg組瘤體積的相對增殖率為61.77%，抑瘤率高達53.67%。

注：*P<0.05，**P<0.01。

圖5 芹菜素對HepG2細胞裸鼠移植瘤體積的影響(n=6)

圖6 芹菜素對HepG2細胞裸鼠移植瘤瘤重的影響(n=6)

2.6 芹菜素對瘤組織內HIF-1α及糖酵解相關蛋白表達的影響

對移植瘤組織的石蠟切片進行免疫組化分析，結果(見圖7)與體外Western blot結果一致，400 mg/kg芹菜素可以明顯降低瘤組織內糖酵解相關蛋白(PDHK1、HKII和LDHA)的表達，同時下調HIF-1α的表達，提示芹菜素在體內也有抑制腫瘤細胞糖酵解的作用。

圖7 芹菜素對HepG2細胞移植瘤組織糖酵解相關蛋白的影響

3 討論

本研究定位于中藥有效成分芹菜素，體內利用裸鼠移植瘤模型驗證芹菜素體內抑制腫瘤糖酵解的效應，并且可以實時、動態地觀察藥物對腫瘤生長的抑制作用。結合經典的體外細胞實驗發現芹菜素在體內外都具有一定的抑制腫瘤細胞糖酵解的作用。進一步研究發現，芹菜素可以通過抑制HIF-1α與DNA的結合能力從而抑制糖酵解發揮其抗腫瘤的作用。

腫瘤細胞能量代謝異常的表現眾多，除糖代謝異常外，腫瘤組織還存在脂肪酸代謝、氨基酸代謝異常[7-8]。糖酵解過度活躍，線粒體有氧代謝削弱，是腫瘤細胞發生糖代謝異常的重要原因[9-10]。HIF-1α作為具有轉錄活性的核蛋白，具有相當廣泛的靶基因譜，在增強腫瘤細胞的糖酵解和促進腫瘤新生血管生成中都十分重要[11-12]。此外，實體瘤缺氧區的存在以及腫瘤細胞糖酵解增強還會導致腫瘤患者對治療產生抵抗，對化療藥物失去敏感產生耐受，最終導致腫瘤的復發與轉移[13-14]。芹菜素有抑制腫瘤細胞糖酵解作用提示：芹菜素可能改善化療藥物耐受，或與化療藥物聯合應用可達到增效減毒的效果，值得進一步探索。本研究為芹菜素用于防治腫瘤展示了有力證據，并提供了新的研究方法和研究模式。