TSA聯合HSV-1對C6鼠膠質瘤細胞株細胞增殖、細胞凋亡的影響

許強華 陳新軍 劉平非 謝 騰 陳曉巍 陳治軍

傳統的手術治療聯合術后放療、化療對惡性膠質瘤的治療效果有限[1]。近年來，尋求惡性膠質瘤新的治療方法越來越被重視。由于傳統的腫瘤放療、化療與病毒生物療法并無交叉耐藥性，因此，可以聯合傳統放療、化療與病毒治療，以達到協同或疊加效應[2]。 本文探討組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑 制 劑 曲 古 抑 菌 素 A（tropicostatin A，TSA）聯合野生型Ⅰ型單純皰疹病毒（herpes simplex virus typeⅠ，HSV-1）對體外培養的大鼠神經膠質瘤細胞（C6 細胞）增殖、凋亡的影響，為HDAC抑制劑聯合溶瘤病毒生物治療惡性膠質瘤提供參考。

1 材料與方法

1.1 C6 細胞培養 常規復蘇C6 鼠膠質瘤細胞株（中科院細胞庫），DMEM+10%FBS+1%雙抗（美國Gibco公司），T25細胞培養瓶培養。細胞長滿培養瓶表面80%～90%，0.25%胰酶（吉林省吉諾生物工程有限責任公司）消化2 min，加新鮮完全培養基終止消化，用移液器輕輕吹散細胞，收集至15 ml離心管中，1 000轉/min 離心5 min，去上清，加入新鮮完全培養基吹散細胞團，細胞計數，細胞懸液按3×104/cm2移至新的培養瓶中傳代。

1.2 HSV-1病毒擴增及滴度測定 接種HSV-1（武漢大學病毒研究所饋贈）懸液0.5 ml 于已鋪有細胞的培養瓶培養，待80%的細胞出現病變后，反復凍融三次，通過CsCl 密度梯度離心法進行抽提、純化HSV-1。最后通過空斑形成實驗準確測定其滴度。

1.3 CCK-8 法檢測C6 細胞增殖活性 細胞消化后計數并調整細胞密度為5×104個/ml。96孔板上每孔加入100 μl 細胞懸液，恒溫培養箱內培養過夜。次日置換新鮮培養基。每孔培養體積200 μl，設對照組（加入等體積培養基）、TSA 組（加入0.5×10-3μmol/L TSA 處理）、HSV-1（加入10 MOI HSV-1 處理）及TSA+HSV-1 組（加入0.5×10-3μmol/L TSA 和10 MOI HSV-1 處理）共4 組，每組設5 個復孔。另設空白調零孔。培養48、72 h 后，每孔加入10 μl CCK-8 溶液（東仁化學科技有限公司），培養箱內孵育2 h。室溫平衡后，用酶標儀測定450 nm處吸光度。計算各組細胞增殖活性。

1.4 C6 細胞凋亡率的檢測 同CCK-8 法制備細胞懸液及分組。培養48、72 h 后，棄去培養基，漂洗后胰酶消化，加完全培養基離心，棄上清。將細胞重懸于400 μl 結合緩沖液中，每管加入5 μl Annexin VFITC 和5 μl PI（美國BD 公司），室溫避光孵育15 min，混勻，70 μm 篩網過濾，轉移至流式管，1 h 內上流式細胞儀檢測。

1.5 RT-PCR 檢測血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA 表達水平 取細胞樣品，加入1 ml RNAiso Plus（Trizol），吹打細胞，加入200 μl氯仿，混均、離心，吸取上清至另一離心管中，加入等量的異丙醇混勻，-20 ℃沉淀，4 ℃離心，棄上清。加入1 ml 75%乙醇，4 ℃離心，棄上清，真空干燥5～10 min。20 μl DEPC H2O 溶解RNA 樣品，RNA純度的測定和RNA 的定量以DEPC H2O 為對照，取2 μl RNA溶液于酶標儀上檢測樣本濃度和質量。將RNA 樣品進行逆轉錄反應及PCR 擴增反應。引物序列：VEGF 正義鏈5'-TCACCGGAAAGACCGATTAAC-3'，反義鏈5'-CCCTTCATGTCAGGCTTTCT-3'；內參GAPDH 正義鏈5'-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3'，反義鏈5'-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3'。1.6 免疫印跡法檢測VEGF蛋白水平 將細胞樣品用胰酶消化、離心、洗滌后轉移至EP管中，加入200 μl的RIPA冰上裂解30 min，4 ℃離心15 min，上清轉移至離心管，用BCA 法檢測細胞裂解液的蛋白濃度。通過制膠，樣品處理后上樣、電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，顯影拍照分析。

1.7 統計學方法 應用SPSS 22.0軟件進行分析；計量資料以±s 表示，采用方差分析；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSA 聯合HSV-1 對C6 細胞增殖活性的影響 處理48、72 h，TSA 組、HSV-1 組、TSA+HSV-1 組C6 細胞增殖活性較對照組顯著降低（P＜0.05），而且，TSA+HSV-1 組C6 細胞增殖活性較TSA 組和HSV-1組明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

2.2 TSA 聯合HSV-1 對C6 細胞凋亡率的影響 處理48、72 h，TSA 組、HSV-1 組、TSA+HSV-1 組C6 細胞凋亡率較對照組顯著增高（P＜0.05），而且，TSA+HSV-1 組C6 細胞凋亡率較TSA 組和HSV-1 組明顯增高（P＜0.05）。見圖2。

2.3 TSA聯合HSV-1對C6細胞VEGF表達水平的影響 處理48、72 h，TSA 組、HSV-1 組、TSA+HSV-1 組C6細胞VEGF mRNA和蛋白表達水平較對照組顯著降低（P＜0.05），而且，TSA+HSV-1 組C6 細胞VEGF mRNA和蛋白表達水平較TSA組和HSV-1組明顯降低（P＜0.05）。見圖3、4。

3 討論

溶瘤病毒的溶瘤特性對治療惡性膠質瘤具有極大潛力，并在很多基礎研究及臨床試驗中得到了證實[3]。HSV-1為研究最早的溶瘤病毒，為了提高溶瘤病毒治療的安全性、靶向性及溶瘤效應，目前已研發出多種基因重組HSV-1[4]。

組蛋白乙?；{控基因表達是重要的表觀遺傳學修飾機制之一。研究表明，由于乙酰化的組蛋白分子電荷的改變，使染色體結構松散而增加轉錄因子和其它轉錄調節分子結合到基因啟動子的機會，激活腫瘤抑制基因的表達，促進腫瘤細胞凋亡[5，6]；同時也通過導致腫瘤細胞周期停滯、阻止癌基因表達抑制腫瘤細胞增殖[7～9]。

一直以來，傳統的放療與化療的聯合作用較易出現交叉耐藥，導致治療效果不理想。由于目前還沒有關于腫瘤細胞對化療和溶瘤病毒交叉耐藥的報道，更重要的是，大多數情況下，對化療抵抗的腫瘤細胞表現出對溶瘤病毒治療的敏感[3]。本研究應用體外C6細胞模型，結果顯示，TSA+HSV-1聯合作用較各單一作用效果更好。這說明TSA 聯合HSV-1對體外培養的C6 細胞可產生協同或疊加殺傷作用。另外，TSA+HSV-1 聯合作用明顯降低C6 細胞VEGF 表達式平，這提示TSA+HSV-1 聯合作用抗腫瘤效應可能與降低VEGF表達有關。