著色性干皮病兩例ERCC2和ERCC5基因突變分析

楊舟 徐哲 焦磊 王珊 馬琳

國家兒童醫學中心 首都醫科大學附屬北京兒童醫院皮膚科100045

通信作者：馬琳，Email：bch_maleen@aliyun.com

著色性干皮病（xeroderma pigmentosum，XP）是一組罕見的常染色體隱性遺傳病，其發病機制為部分基因突變導致DNA 損傷修復能力受損，從而引發光敏、皮膚損傷、眼部病變、神經損害、惡性腫瘤、發育障礙等。皮膚癌為XP 患者的主要死因，神經退行性疾病是第二大死因［1］。目前報道XP 共有7個互補型（XPA、XPB、XPC、XPD、XPE、XPF、XPG）和1 個變異型（XPV），分別對應8 種基因（XPA、ERCC3、XPC、ERCC2、DDB2、ERCC4、ERCC5、POLH）突變［2］。本研究采用高通量測序對2 例XP患者進行全外顯子組測序（whole ? exome sequencing，WES），結合Sanger測序驗證，明確其分別為XPD型及XPG型。

資料與方法

一、病歷資料

例1 男，3 歲，出生時皮膚外觀正常，日曬后面部出現紅斑和腫脹，隨后皮膚粗糙、干燥，逐漸出現散在的雀斑樣病變和色素痣。皮疹夏季加重，以光暴露部位為主。近1年出現步態不穩，行走時易跌倒。體檢：面、耳、頸部和雙手背可見大量褐色斑點、斑片，間雜色素減退斑，散在疣狀丘疹，軀干散發黑褐色斑丘疹（圖1）。神經系統檢查：步態不穩，易跌倒，四肢肌張力正常，深部腱反射可引出；指鼻試驗、閉目難立征、輪替試驗均陰性，未見共濟失調；語言發育落后，無法表達完整的句子，智力篩查落后于正常同齡兒范圍。其余系統檢查未見明顯異常。眼科檢查正常；純音測聽未發現感音性耳聾；頭顱磁共振成像檢查大致正常，未見腦萎縮、腦室擴張、基底節及大腦皮質鈣化等。

例2 男，1 歲5 個月，生后3 個月日曬后面部出現輕度潮紅腫脹，后逐漸出現面部褐色斑點。體檢：面部散在褐色斑點、斑片，伴少許色素減退性斑（圖2）。體檢：神經及其他系統未見異常。眼科、聽力檢查正常。

2例患兒均為第1胎第1產，父母非近親結婚，無類似疾病家族史。囑患者防曬、避光，隨訪2年，2例患兒皮損均較前有所增多，未出現惡性腫瘤。

二、方法

1.標本采集：用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管收集患兒及其父母外周靜脈血3 ml，使用北京天根生化科技有限公司DNA 提取試劑盒提取DNA（總量＞10 μg，50 mg/L）。本研究符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》（https://www.wma.net/policies?post/wma?declaration?of?helsinki?ethical?principles?for?medical?research?involving?human?subjects/）的要求，患兒監護人及健康對照同意基因檢測并簽署知情同意書。

2.基因突變檢測：①WES測序，稀釋DNA后采用Covaris 超聲儀隨機分解成小片段DNA（180 ～280 bp），后經探針雜交和外顯子區序列捕獲，制備文庫并質檢，在北京康旭醫學檢驗所應用美國Illumina 公司的Hiseq X Ten 測序平臺進行測序，應用BWA（v0.7.15）軟件將測序read與人類參考基因組對比，應用GATK（v3.6）軟件檢測單核苷酸變異和插入/缺失突變；②注釋分析，使用ANNOVAR 注釋軟件注釋變異在基因和轉錄本中的位置，基因相關注釋涉及RefSeq、Ensembl、UCSC等數據庫，利用千人基因組、GnomAD、TOPMED 等數據庫注釋變異在人群中的頻率，使用蛋白損傷分析工具PolyPhen?2、SIFT 及Mutation Taster 進行致病性分析，利用OMIM、HGMD、ClinVar 等數據庫對疾病進行注釋，重點關注著色性干皮病相關基因XPA、ERCC3、XPC、ERCC2、DDB2、ERCC4、ERCC5 及POLH；③Sanger測序驗證，針對單基因所需要驗證的位點所在外顯子/內含子的上下游序列設計引物（表1），對患兒突變位點進行PCR擴增，反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s、60 ℃復性30 s、72 ℃延伸45 s、共35個循環，72 ℃延伸5 min。PCR產物純化后用ABI 3 730測序儀進行Sanger雙向測序，獲得數據后對結果進行判讀，與Ensembl genome browse 90公布的序列比對分析。進一步對患兒父母進行驗證，確定突變來源。

圖1 例1臨床表現 面部（1A）、背部（1B）、頸部（1C）、雙手背（1D）散發大量褐色斑點、斑片，伴色素減退斑，散發疣狀丘疹 圖2 例2面部散發褐色斑點、斑片，伴少許色素減退斑

結 果

例1存在ERCC2基因復合雜合突變，即父源突變c.1805G＞A（p.Gly602Asp）和母源突變c.586C＞T（p.Arg196Ter）（圖3），患兒符合XPD 型。例2 存在ERCC5 基因復合雜合突變，即父源突變c.2533+2T＞C 和母源突變c.2453C＞T（p.Ala818Val）（圖4），患兒符合XPG 型。例1 的ERCC2 基因突變c.586C＞T導致編碼第196號氨基酸Arg的密碼子變成終止密碼子，為無義突變；例2 的ERCC5 基因突變c.2533+2T＞C為編碼區第2 533位核苷酸后11位內含子中第2位核苷酸由T變為C，為剪切變異，經fruitfly 網站（www.fruitfly.org/seq_tools）剪切位點預測工具預測，突變將導致原有的剪切位點散失，很可能無法正常剪切，導致蛋白功能出現異常。以上兩個突變既往未見報道，在千人基因組、GnomAD、TOPMED 等健康人群對照數據庫中未發現或頻率極低，不屬于多態性位點。而ERCC2 基因突變c.1805G＞A 和ERCC5 基因突變c.2453C＞T 為已報道的致病性變異，使用SIFT、Polyphen?2和MutationTaster 軟件對2 個錯義突變c.1805G＞A 和c.2453C＞T 進行功能預測，均分別為“有害”、“很可能損害”和“致病性”，顯示其可能致病。Mutation Taster 軟件對無義突變c.586C＞T 預測為“致病性”，可產生截短蛋白，影響蛋白功能。PolyPhen?2軟件顯示分析c.1805G＞A、c.2453C＞T 及c.586C＞T 突變所在位點均在不同物種間高度保守。

表1 ERCC2和ERCC5基因Sanger測序引物序列

圖3 例1著色性干皮病患兒ERCC2基因復合雜合突變測序圖 3A：先證者發生錯義突變c.1805G＞A（p.Gly602Asp）和無義突變c.586C＞T（p.Arg196Ter）；3B：先證者父親發生錯義突變c.1805G＞A；3C：先證者母親發生c.586C＞T無義突變 圖4 例2著色性干皮病患兒ERCC5基因復合雜合突變測序圖 4A：先證者發生（父源）剪切突變c.2533+2T＞C和（母源）錯義突變c.2453C＞T（p.Ala818Val）；4B：先證者父親發生剪切突變c.2533+2T＞C；4C：先證者母親發生錯義突變c.2453C＞T

討 論

XPA ～XPG型XP是由涉及核苷酸切除修復機制的蛋白基因缺陷引起。NER可修復紫外線、化學試劑、毒性物質及化療藥物等引起的DNA損傷，以及一些因氧化還原過程產生的損傷［3］。不同分型的XP患者臨床表現有所差異，不同地域種族XP分型亦有差異。在日本XPA 占較大比例；在美國XPC 占優勢，其次為XPD 或XPV；在歐洲XPC 占主要比例，其次為XPV［4］。檢索HGMD Pro、PubMed及萬方和CNKI 數據庫顯示，截至2019 年10 月，我國XPA、XPC占優勢［4?7］，XPV并不少見［5，7?8］，而XPD僅報道2 例［5?6］，XPG 報道5 例［5?7］。本文報道XPD、XPG各1例，其中XPD為我國少見類型。與其他地區人群XPG罕見相比，我國XPG并不少見，且本例患者癥狀較輕。

XPD（OMIM#278730）由ERCC2 基因突變引起5′?3′ATP 依 賴 的DNA 解 鏈 酶XPD 活 性 降 低 所致［9］。目前已報道100 余種與疾病相關的ERCC2基因突變，其基因型與表型關系復雜，可導致多種癥狀且嚴重程度差異很大，如XPD、XPD 合并Cockayne綜合征、毛發硫營養障礙、XP合并毛發硫營養障礙或腦-眼-面-骨骼綜合征［4，10］。XPD患者常早期發病，臨床表現嚴重（但輕于XPA），伴急性曬傷反應，雀斑樣色素沉著明顯，皮膚癌發生率較高［10］。XPD 患者多數可出現原發性神經元變性導致的進行性神經系統損害，如進行性步態不穩、肌張力低下、痙攣、癲癇等。這些癥狀開始于生命早期，亦可較晚出現，特征為髓鞘形成不足或異常、腦萎縮、鈣沉積和腦細胞異常［3］。患者神經系統癥狀不能完全用紫外線損傷修復缺陷解釋，還可能涉及核苷酸切除修復蛋白參與活性氧產生的損傷修復［3］。

我國既往僅報道2例XPD患者，均為復合雜合錯義突變所致，尚未發現神經系統癥狀，其中p.Gly47Arg 位于HD1 區，p.Ile595Ser、p.Gly602Asp、p.Arg666Trp 均位于HD2 區（圖5A）［5?6］。位于HD2區的突變可導致XP、XP 合并Cockayne 綜合征、毛發硫營養障礙或XP 合并毛發硫營養障礙表型［4］。本研究中例1 患兒存在錯義突變和無義突變的復合雜合突變，其錯義突變p.Gly602Asp 位于HD2 區域（圖5A），既往報道可引起XP合并Cockayne綜合征。另有研究者報道HD2 區中突變Arg683Trp 可導致XP表型及神經系統疾病進展［4］，而Arg683Gln可導致神經系統輕度異常或晚期發作［10］。p.Arg196Ter 為無義突變，產生截短蛋白，且位于4FeS 簇區域（圖5A），推測其對酶活性影響較大。位于4FeS 簇區的突變可導致XP 或毛發硫營養障礙表型，其中I199Pfs*52 突變亦可導致XP 表型［11］。本文例1目前已出現大量雀斑樣色素沉著、皮膚異色、疣狀丘疹的XP皮膚表現，以及神經系統異常如步態不穩、語言及智力發育落后。有研究顯示，合并神經退行性疾病的XP 患者更早發生皮膚癌［2］，故該患兒需嚴格避光防曬，預防皮膚腫瘤發生。XP 患者發生腦腫瘤的風險可增加50 倍，包括髓母細胞瘤、膠質母細胞瘤、脊髓星形細胞瘤和神經鞘瘤［3］。該患兒目前頭部磁共振成像檢查雖未見明顯異常，仍需密切觀察其神經系統癥狀進展。

XPG（OMIM 278780）是由ERCC5 基因突變引起結構特異性修復核酸內切酶XPG 活性缺陷所致，目前已報道50 余種ERCC5 基因突變與疾病相關。XPG 患者早期發病，伴急性曬傷反應，有明顯的雀斑樣色素沉著，可合并神經系統異常、Cockayne 綜合征或腦-眼-面-骨骼綜合征。其表型廣泛，可從輕微到極度受累和進行性神經元死亡導致的神經系統異常［12］。雖有報道本型患者于20歲可發生皮膚癌［1］，但英國一項研究提示，XPG 患者皮膚癌的發生可能少于其他XP亞型［4］。

圖5 ERCC2和ERCC5蛋白結構及我國XPD和XPG型著色性干皮病患者基因突變位點 5A：ERCC2共5種突變；5B：ERCC5共8種突變。下劃線指示本研究中突變

我國既往報道的5 例XPG 患者中，3 例表現為輕度表型，暫未見腫瘤發生［5，7］；1 例無義突變和錯義突變（p.Gln233Ter，p.Gly2Trp）患者合并恐懼癥、記憶力差及感覺神經性耳聾［13］；1例復合雜合無義突變（p.Gln37Ter，p.Lys392Ter）患者合并智力減退［5］。本研究中例2 表現為輕度癥狀，存在剪切突變c.2533+2T＞C 和錯義突變p.Ala818Val。盡管突變均位于核酸內切酶活性區域（I區）內（圖5B），但與無義或移碼突變相比，剪切突變和錯義突變對蛋白的影響可能相對較小，保留了一些殘留功能而導致輕癥。既往研究者推測ERCC5基因的蛋白截短突變可導致XPG/Cockayne 綜合征，攜帶至少1 個ERCC5 非截短突變的患者可能具有輕度XPG 表型［14］，本研究結果支持該推測，并顯示I區的錯義和剪切突變亦可導致輕癥表型。但有文獻報道兩姐弟患者核酸內切酶I 區純合錯義突變p.Leu778Pro導致輕度XP 皮膚表型合并輕微神經異常［15］。本研究中患兒年齡較小，仍需進一步觀察是否出現遲發性神經系統癥狀。

本文提醒臨床醫生需提高對XP早期臨床表現的認識，以期早診斷、早防治。XPG 患者早期臨床表現可較為輕微；合并神經系統異常的患者除XPA外，應注意XPD 的可能。由于本病致病基因較多，臨床表型復雜，單獨應用Sanger 測序費時、費力且費用較高，采用高通量WES 結合Sanger 測序驗證的方法可快速、準確、經濟地進行基因診斷和分型，進一步指導預后及遺傳咨詢。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突