養(yǎng)血飲顆粒中黃芪甲苷的含量測定

1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2.吉林敖東集團(tuán)力源制藥股份有限公司，吉林 敦化 133700

養(yǎng)血飲顆粒由當(dāng)歸、黃芪、大棗、鹿角膠、阿膠五種藥味組成，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、益腎助脾的功效[1-3]，是吉林敖東集團(tuán)力源制藥股份有限公司生產(chǎn)的中藥顆粒劑產(chǎn)品，現(xiàn)行養(yǎng)血飲顆粒劑標(biāo)準(zhǔn)中含量測定為薄層掃描法[4-6]測定養(yǎng)血飲顆粒中黃芪甲苷的含量，由于薄層掃描法含量測定結(jié)果精密度低，重復(fù)性差，專屬性差，使質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)陳舊，不能很好的對產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行控制，嚴(yán)重影響制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用[7-10]，因此，確定養(yǎng)血飲顆粒黃芪甲苷含量測定的合適方法，提高養(yǎng)血飲顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)勢在必行，本研究將采用高效液相色譜法，蒸發(fā)光檢測器對養(yǎng)血飲顆粒中黃芪甲苷進(jìn)行含量測定，提高養(yǎng)血飲顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該制劑后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Agilent 1260)，蒸發(fā)光檢測器(Agilent，低溫型)；空氣發(fā)生器(XWK-Ⅲ)；Phenomenex Luna C18 (4.6mm×250 mm，5μm)色譜柱；黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，110781-201717，純度96.9%)；養(yǎng)血飲顆粒(吉林敖東集團(tuán)力源制藥股份有限公司，規(guī)格為5 g/袋，批號180101、180102、180303、190101、190104、190302、090303、190304、190501、190502)乙腈為色譜純；水為超純水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液制備 取本品，研細(xì)，取約5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，加熱使溶解，用水飽合正丁醇提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按比例取組方中除黃芪以外的其余藥材，按照制備工藝制備陰性樣品，取陰性樣品5 g，按2.1.1方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)性試驗(yàn) 以十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(32∶68)為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器檢測，空氣發(fā)生器0.4 MPa，漂移管50℃；檢測波長270 nm；流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。精密吸取對照品溶液10 μL，供試品溶液和陰性樣品溶液各15 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，結(jié)果供試品與黃芪甲苷對照品色譜圖有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性無干擾，結(jié)果如圖1、圖2、圖3所示。

圖1 對照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

圖3 陰性樣品色譜圖

2.3 方法驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 線性 精密稱取黃芪甲苷對照品16.58 mg，加甲醇定容至25 mL量瓶中，得濃度為0.6632mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液，該溶液加甲醇等比稀釋制成濃度為0.0663 mg/mL、0.0829 mg/mL、0.1658 mg/mL、0.3316 mg/mL對照品溶液，精密吸取上述5種不同濃度對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀。以對照品進(jìn)樣量(μg)的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積常用對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果黃芪甲苷在0.66～6.63μg范圍內(nèi)，Y=1.6659X+2.5421(r=0.9991)，進(jìn)樣量常用對數(shù)與峰面積常用對數(shù)呈線性關(guān)系。

2.3.2 精密度 取同一份供試品溶液(190302)連續(xù)進(jìn)樣測定6次，每次15μL，測定其色譜峰面積值，RSD為1.58 %，結(jié)果表明精密度良好，結(jié)果見表1。

表1 精密度結(jié)果

2.3.3 重現(xiàn)性 取同一批樣品(190302)，按2.1.1方法平行制備6份供試品溶液，依法進(jìn)行測定，結(jié)果黃芪甲苷含量平均值為0.22 mg/g，RSD值為1.47 %。表明該方法重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表2。

表2 重現(xiàn)性結(jié)果

2.3.4 穩(wěn)定性 取本品(190302)約5 g，按2.1.1方法制備供試品溶液，分別于0、3、6、12、24 h進(jìn)行測定，每次進(jìn)樣量15 μL，RSD為2.61 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性結(jié)果

2.3.5 回收率 精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇溶解，設(shè)計(jì)3種不同濃度的對照品溶液(低、中、高濃度對照品溶液濃度分別為0.0061 mg/mL、0.0122 mg/mL、0.0183 mg/mL)，每種濃度分別制備3份溶液進(jìn)行測定，低、中、高濃度對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比分別控制在0.5∶1，1∶1，1.5∶1左右。取本品(190302，含量0.22 mg/g)9份，每份約2.5 g，精密稱定，分別精密加入低、中、高濃度對照品溶液50 mL，依法測定，回收率平均值為97.81 %，RSD為3.94 %，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表4。

表4 回收率結(jié)果

2.4 含量測定 取養(yǎng)血飲顆粒10批樣品(批號180101、180102、180303、190101、190104、190302、090303、190304、190501、190502)，按2.1.1方法制備供試品溶液，精密吸取對照品溶液5 μL、10 μL，供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算黃芪甲苷含量，結(jié)果見表5。

表5 養(yǎng)血飲顆粒十批樣品黃芪甲苷含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 樣品的提取[11]以甲醇為提取溶劑，考察超聲提取、回流提取、索氏提取三種提取方法，結(jié)果回流提取和索氏提取測定結(jié)果無顯著差異且明顯高于超聲提取測定結(jié)果，因此采用回流提取方法。并對提取時(shí)間和提取溶劑量進(jìn)行了單因素考察；另外，黃芪中的某些皂苷類成分在堿性條件下可轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷(黃芪皂苷Ⅳ)，因此在處理樣品時(shí)，通常使用氨試液對供試品進(jìn)行堿化，氨試液用量和洗滌次數(shù)在一定程度上影響黃芪甲苷測定結(jié)果。參考《中國藥典》2015年版一部黃芪【含量測定】項(xiàng)下供試品制備方法，以氨試液每次用量為40 mL為基礎(chǔ)，對洗滌次數(shù)進(jìn)行考察，數(shù)據(jù)顯示，氨試液洗滌2次和3次結(jié)果無顯著差異且略高于洗滌1次測定結(jié)果，因此，采用氨試液洗滌2次的方法。

3.2 色譜條件的選擇 參考《中國藥典》2015年版一部黃芪【含量測定】流動相組成，以乙腈、水為流動相組成并對二者比例進(jìn)行考察，結(jié)果乙腈∶水為38∶62時(shí)，黃芪甲苷色譜峰與其他雜峰分離度大于1.5，保留時(shí)間適中。因此，確定乙腈∶水(38∶62)為流動相，同時(shí)對流速、柱溫、不同色譜柱等色譜條件進(jìn)行了考察，確定流速為1.0mL/min，柱溫為35 ℃，色譜柱為C18(4.6mm×250 mm,5μm)，漂移管溫度為50 ℃，結(jié)果表明本研究方法穩(wěn)定、專屬性強(qiáng)、靈敏度高[12]，適合用于養(yǎng)血飲顆粒中黃芪甲苷的含量測定。