沉默SOX4抑制骨肉瘤細胞的生長和轉移

傅 薔,史紀元,趙 婷,查鷺婷,劉安生(西安市兒童醫院血液腫瘤科,西安 70003;陜西省人民醫院骨科;通訊作者,E-mail:ShiJYsy@63.com)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是最常見的原發性惡性骨腫瘤,青少年具有較高的發病率[1,2]。新輔助化療的使用雖然明顯增加了骨肉瘤患者的5年生存率,但骨肉瘤患者的預后仍十分兇險[3],因此,需要探索抑制腫瘤轉移的新療法。性別決定區Y框蛋白4(SOX4)是一種47 kD蛋白,包含3個可區分的結構域,即高遷移率基團(HMG)DNA結合結構域(DBD)、富含甘氨酸的結構域和富含絲氨酸的結構域[4-7]。DBD與TCF/LEF轉錄因子家族有關,并具有促進細胞凋亡的功能[8]。SOX4通過其HMG域與包含7 bp DNA基序AACAAAG的靶基因結合,從而在轉錄水平上激活靶基因[9]。大量研究證明,SOX4在胚胎發育、細胞生長和分化中起重要作用[4-7]。近年來,SOX4基因在腫瘤發生中的作用越來越受到重視,并發現該基因在包括食道癌、肝癌、乳腺癌和非小細胞肺癌在內的多種人類惡性腫瘤中過表達,并且與患者的預后明顯相關[10-12]。然而,目前尚未確定人骨肉瘤中SOX4表達水平與患者預后的關系。本研究推測骨肉瘤中可能存在SOX4的異常表達,并且SOX4可能在骨肉瘤進展中發揮作用。因此,本研究旨在揭示SOX4與人骨肉瘤患者臨床病理指標之間的關系,探討SOX4在體內外對人骨肉瘤細胞生長和轉移的調控機制。

1 材料與方法

1.1 病例樣本收集

收集2016-01～2018-12西安市兒童醫院血液腫瘤科確診的30例骨肉瘤患者的手術活檢骨肉瘤樣本,患者先前均未進行任何化放療及藥物治療。觀察骨肉瘤患者SOX4表達與臨床指標的關系。

1.2 骨肉瘤組織中SOX4的免疫組化染色

將石蠟包埋的骨肉瘤組織切片在60 ℃熱處理1 h,二甲苯脫蠟,梯度乙醇(100%-50%)水化,然后用pH 6.0的0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復。用含0.3% H2O2的甲醇抑制內源性過氧化物酶活性30 min。將切片與SOX4一抗(英國Abcam公司)在4 ℃孵育過夜。然后在37 ℃下與生物素化的二抗(英國Abcam公司)孵育1 h。切片用二氨基聯苯胺(DAB,艾美捷科技有限公司)顯色。陽性細胞被染為棕色和深棕色,陰性細胞為淡黃色或未染色。隨機選擇5個載玻片區域計算陽性細胞百分比。將大于50%細胞陽性染色的樣本定義為陽性,否則為陰性。

1.3 細胞培養

人骨肉瘤細胞系Saos-2和人成骨細胞hFOB 1.19購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。細胞均在添加10%胎牛血清(美國Invitrogen公司)、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 mg/ml,美國Invitrogen公司)的Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM,美國Invitrogen公司)中培養。培養條件:5% CO2,33.5 ℃。

1.4 SOX4-shRNA細胞轉染

由上海吉凱基因化學技術有限公司合成SOX4短發夾RNA(SOX4-shRNA),并將其克隆到pGFP-V-RS逆轉錄病毒載體中。pGFP-V-RS-SOX4-shRNA序列為:AGCCCTCGAACTCAAAGCACGCCTCAGGC,陰性對照shRNA(pGFP-V-RS-NC-shRNA)序列為:GCAAGTAACTAGCCACCAGGATCTATACT。將細胞接種在24孔板,每個孔中的細胞生長至80%融合后,按照制造商的說明,用Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)將shRNA轉染細胞48 h。

Annexin Ⅴ/PI分析顯示,與NC-shRNA組相比,SOX4敲低組細胞凋亡率明顯增加(1.54%±0.18%vs23.37%±3.19%,P<0.001,見圖4)。為了進一步研究SOX4基因沉默對骨肉瘤細胞凋亡的誘導機制,本研究檢測了敲低SOX4對細胞凋亡相關蛋白的影響。研究結果顯示,與NC-shRNA組相比,SOX4敲低組骨肉瘤細胞中促凋亡蛋白Bax和P53的蛋白表達水平顯著升高(均P<0.001),分別升高了3.54±3.04倍和3.11±0.19倍,而抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達水平顯著降低(降低了78.86%±5.67%,P<0.001,見圖5)。

1.5 RT-PCR檢測細胞中SOX4 mRNA水平

使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取細胞總RNA。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(日本TaKaRa公司)和ABI 7500型定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)進行RT-PCR。引物序列如下。SOX4正向:5′-CTAGCCATGTGACATGGATGATTTT-3′,SOX4反向:5′-CGCATATGTACACATGGCGTGTGTGA-3′;GAPDH正向:5′-GGGATCTACGTACACACCTGTGCCG-3′,GAPDH反向:5′-GTTGTGCCTAGGGACCATATACCCA-3′。PCR條件為95 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共循環40 次。使用GAPDH作為內參基因,并根據2-ΔΔCt法計算SOX4 mRNA的相對表達量。

1.6 Western blot檢測細胞中SOX4、Bax、P53、Bcl-2、MMP2、MMP9和Fibronectin的蛋白水平

傷口愈合實驗顯示,在培養48 h時,與NC-shRNA組相比,SOX4敲低組細胞的傷口面積明顯升高(升高了76.87%±6.72%,P=0.009,見圖6A)。基質膠侵襲實驗顯示,與對照細胞相比,SOX4敲低組的細胞侵襲數明顯降低(降低了58.53%±5.44%,P<0.001,見圖6B)。

1.7 Cell Counting Kit-8檢測細胞增殖

使用PE Annexin Ⅴ細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD Bioscience公司)進行細胞凋亡測定。將細胞在PBS中洗滌3次,重懸于300 μl結合緩沖液中。分別將Annexin Ⅴ和碘化丙啶(PI)添加到溶液中,渦旋振蕩,黑暗中孵育20 min。加入結合緩沖液并通過流式細胞術分析細胞。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡

通過Cell Counting Kit-8(CCK-8,東仁化學科技(上海)有限公司)細胞增殖測定法測定骨肉瘤細胞的增殖能力。按照10 000個/孔的密度將細胞接種在96孔板,在無血清培養基中37 ℃下孵育24 h。將20 μl CCK-8溶液添加到每個孔中,然后將細胞在37 ℃下孵育,使用酶標儀檢測450 nm處的光密度值(OD)。

王莽史建國三年（公元11年）河水在魏郡元城（今河北大名東）以上決口，洪水泛濫了近六十年，到東漢明帝永平十二年（公元69年），經過王景治河后，出現了一條新河道，即《水經注》以及唐代《元和郡縣志》里的黃河。這條黃河已較西漢大河偏東，經今黃河和馬頰河之間至利津入海。這條大河穩定了六百多年，其間當然也有多次決口，但無大的改流。直到唐朝末年開始在河口段有部分河段改道。[10]（鄒逸麟，1980，黃河下游河道變遷及其影響概述）宋朝初年，棣州（今山東惠民、濱縣一帶）境內“河勢高民屋殆逾丈”。

1.9 傷口愈合實驗評估細胞的遷移能力

實心球投擲項目一直在初中體育課田徑部分占有很重要的地位，尤其是作為體育中考的重要項目，雖然是選擇性項目，但仍然越來越多地被學生、家長所關注，成為近些年中考體育的重點關注項目。就原地雙手向前投擲實心球而言，是發展上肢肌肉的速度力量和爆發力、全身用力素質、腰腹背肌力量以及身體靈活性、協調性的運動項目。對于上肢肌肉的速度力量、快速爆發用力要求較高；對于腰腹背肌的收展用力要求較高；對于全身的靈活協調用力要求較高；對于自身的動作控制力要求較高。

1.10 BioCoat Matrigel測定細胞侵襲能力

轉染攜帶SOX4-shRNA的pGFP-V-RS病毒載體后,Saos-2細胞系中SOX4的mRNA和蛋白表達分別降低了75.09%±6.42%和78.94%±7.11%(均P<0.001,見圖2)。CCK-8檢測顯示,與NC-shRNA組相比,SOX4敲低組在細胞培養48 h和72 h時細胞增殖能力顯著降低(分別降低了40.78%±3.70%和31.71%±2.09%,P=0.004和P=0.002,見圖3)。

將細胞接種在6孔板中并培養直至90%融合。使用20 μl移液器尖頭將單層細胞劃出傷口。在細胞培養48 h時用新鮮培養基將板洗滌1次以除去未黏附的細胞,然后拍照計算傷口愈合程度。

隨著數字網絡化技術的發展，圖書館的管理模式、服務功能也發生了巨大變化，從單一的靜默閱讀服務，發展成為團隊研討，為雙創發展提供共享學習空間。為此，圖書館辦館方針任務也要隨之調整，要打造特色空間、智慧空間，整合文獻資源，建設特色資源，提高館藏利用率，處理好傳統文獻存儲空間與特色共享學習空間的相互依存、相互促進的關系。這也是我們特色建館的關鍵。

1.11 小鼠異種移植腫瘤模型的建立

將1×106個用SOX4-shRNA或NC-shRNA轉染的Saos-2細胞懸浮在200 μl PBS中,分別皮下注射到SPF級6周齡雌性BALB/c裸鼠的背部(n=10),裸鼠由陜西省人民醫院動物實驗中心[SYXK(陜)2016-006]提供。定期測量腫瘤體積,腫瘤體積=0.5×長度×寬度2。第4周處死小鼠并分離腫瘤組織,然后固定在甲醛中進行組織病理學分析。

1.12 統計學分析

使用SPSS22.0軟件進行統計分析。結果表示為平均值±標準差。兩組間比較使用雙尾t檢驗,多組間比較使用單因素方差分析(One-ANOVA)及事后LSD檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

從以上幾個實例可以看出，巖礦石標本電性參數測量結果的可靠程度與測量采用方法、方式關系不大，主要取決于標本的采集、加工及測量過程，據此，本人總結了以下幾點認識：

2 結果

2.1 SOX4在骨肉瘤組織和細胞系中的表達

RT-PCR和Western blot結果顯示,人骨肉瘤細胞系Saos-2中SOX4的mRNA和蛋白表達水平顯著高于和人成骨細胞hFOB 1.19(分別升高了3.23±0.42倍和3.76±0.38倍,均P<0.001)。此外,骨肉瘤組織中SOX4存在較高比例的陽性表達(SOX4陽性細胞比例大于50%,見圖1)。SOX4的陽性表達與患者TNM分期和遠處轉移有關,即高TNM分期或發生遠處轉移患者的骨肉瘤組織中SOX4的陽性率更高。SOX4的陽性表達與年齡、性別和腫瘤大小無明顯相關性(見表1)。

與hFOB1.19細胞比較,*P<0.05

表1 骨肉瘤患者SOX4表達與臨床指標的關系 (例)Table 1 Relationships between SOX4 expression and clinical parameters in patients with osteosarcoma (cases)

2.2 下調SOX4對骨肉瘤細胞增殖的影響

使用BioCoat Matrigel進行細胞侵襲測定(美國BD Bioscience公司)。將1×105個細胞懸浮在無血清的DMEM上室中,下室為含有10% FBS的完整培養基。細胞在37 ℃孵育24 h,將細胞用0.5%結晶紫染色并在倒置顯微鏡下(×100)拍照。隨機選擇5個視野計算平均侵襲細胞數。

與NC-shRNA比較,*P<0.05

與NC-shRNA比較,*P<0.05

2.3 下調SOX4對骨肉瘤細胞凋亡的影響

結晶設備與蒸汽單元設備類似，在其單元后接閃蒸罐。固液分離后，所產生的結晶鹽含有大量的雜質，其回收利用的成本高于普通工業鹽的生產成本。加大結晶單元的提純技術，若能實現多種結晶鹽的高純度分離，將成為燃煤電廠的第二經濟增長點。

圖4 流式細胞術檢測下調SOX4對骨肉瘤細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of down-regulating SOX4 on osteosarcoma cell apoptosis detected by flow cytometry

圖5 Western blot檢測下調SOX4對細胞凋亡相關蛋白表達的影響Figure 5 Effect of down-regulation of SOX4 on apoptosis-related protein expression by Western blot

2.4 下調SOX4對骨肉瘤細胞遷移和侵襲的影響

使用冰RIPA裂解液[中科瑞泰(北京)生物科技有限公司]對細胞進行裂解。將細胞裂解液在4 ℃下于10 000 r/min離心15 min,收集上清液用于蛋白質濃度測定。在10%SDS-PAGE凝膠上分離總蛋白,并轉移到硝酸纖維素膜(美國Millipore公司)。將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h,然后與一抗在4 ℃下孵育過夜。使用的一抗包括SOX4(1∶500稀釋,美國Santa Cruz公司)、Bax(1∶1 000稀釋,美國Cell Signaling Technology公司)、P53(1∶500稀釋,美國Santa Cruz公司)、Bcl-2(1∶1 500稀釋,英國Abcam公司)、MMP2(1∶1 000稀釋,美國Cell Signaling Technology公司)、MMP9(1∶1 000稀釋,美國Cell Signaling Technology公司)、Fibronectin 1(1∶3 000稀釋,英國Abcam公司)和GAPDH(1∶1 000稀釋,英國Abcam公司)。然后將膜在TBST溶液中洗滌3次,每次15 min,然后與辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h(北京博奧森生物技術有限公司)。使用超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物技術研究所)進行顯影。GAPDH作為內參。

與NC-shRNA比較,*P<0.05

本研究檢測了敲低SOX4對骨肉瘤細胞中腫瘤轉移相關蛋白表達的影響,研究顯示,與NC-shRNA組相比,SOX4敲低組細胞中MMP2、MMP9和Fibronectin 1蛋白表達顯著降低(均P<0.001,見圖7),依次降低了67.13%±6.09%,83.04%±7.76%,71.79%±6.21%。

圖7 Western blot檢測下調SOX4對腫瘤轉移相關蛋白表達的影響Figure 7 Effect of down-regulation of SOX4 on tumor metastasis-related protein expression by Western blot

2.5 下調SOX4對異種移植腫瘤模型小鼠腫瘤生成的影響

異種移植腫瘤模型實驗顯示,與接種對照細胞的小鼠相比,接種了SOX4敲低的細胞的小鼠腫瘤體積在生長21 d和28 d時顯著降低(P=0.012和P<0.001,見圖8),分別降低了49.33%±5.12%和50.21%±4.78%。

圖8 下調SOX4對異種移植腫瘤模型小鼠腫瘤體積的影響Figure 8 Effect of down-regulation of SOX4 on tumor volume in xenograft tumor model mice

3 討論

SOX4是一種具有多種生物學功能的轉錄因子,SOX4基因編碼474個氨基酸組成的蛋白質,也是一種單外顯子基因,大量研究證明SOX4在胚胎發育、細胞生長和分化中起重要作用[4-7]。近年來,SOX4基因在腫瘤發生中的作用越來越受到學者的重視。目前,有學者已經在非小細胞肺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、結直腸癌、前列腺癌、血液系統惡性腫瘤等多種人類惡性腫瘤中發現了SOX4的異常表達,并且SOX4的異常表達與腫瘤特性和患者預后明顯相關,SOX4的高表達是患者不良預后的生物標志物[13-16]。據報道,在胃癌組織中, SOX4表達與腫瘤細胞浸潤、血管浸潤、淋巴結轉移和遠處轉移有關。生存分析表明,高表達SOX4的患者的無病生存期短于低表達的患者[17]。目前,尚未確定人骨肉瘤中SOX4表達水平的預后意義。本研究結果顯示,人骨肉瘤組織和細胞系中SOX4的表達水平顯著升高,并且SOX4的高表達與TNM分期和遠處轉移有關,TNM分期越高或發生遠處轉移的患者的SOX4普遍高表達。上述結果說明,在成骨細胞惡性轉化過程中SOX4被上調并在骨肉瘤中發揮致癌作用,SOX4的異常上調可能促進了骨肉瘤惡性表型。因此,SOX4可作為骨肉瘤判斷預后的潛在分子生物標志物。

本研究通過轉染攜帶SOX4-shRNA的pGFP-V-RS病毒載體敲低了Saos-2細胞系中SOX4的mRNA和蛋白表達。進一步研究顯示,敲低SOX4后顯著抑制了骨肉瘤細胞的增殖,并促進了細胞凋亡。一些研究表明,SOX4主要通過抑制細胞凋亡來促進腫瘤發生[18]。SOX4通過阻斷Mdm2介導的P53降解并促進p300/CBP/P53復合物形成誘導凋亡,抑制腫瘤發生[19]。在肺癌細胞H1299中,SOX4通過增加PUMA表達并以非P53依賴性的方式誘導細胞凋亡[20]。SOX4的抑制凋亡作用主要是通過Caspase-3依賴性途徑引起的[21]。Bcl-2家族成員在細胞凋亡過程中發揮非常重要的作用,該家族可分為兩大類,一類具有抗凋亡作用,包括Bcl-2、Bcl-XL等;另一類具有促凋亡作用,包括Bax、Bak等。Bax/Bcl-2的比例是決定細胞凋亡的關鍵因素。Bax基因編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體,并抑制Bcl-2的功能。p53是一種腫瘤抑制基因,其在大多數惡性腫瘤中均存在基因突變。p53基因編碼的蛋白質控制細胞周期的啟動,當基因發生突變后,由于蛋白空間構象的改變導致其失去了對細胞生長、凋亡和DNA修復的調控作用。此外,p53可以上調Bax的表達并下調Bcl-2的表達。本研究結果顯示,敲低SOX4顯著上調了促凋亡蛋白Bax和P53的蛋白表達水平,并下調了抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達水平。提示在骨肉瘤細胞中,SOX4對細胞凋亡的調控作用是通過Bax、P53和Bcl-2介導的。

圖6為傳感器系統紅外光源HSL5-115-S的驅動電路。單片機通過DAC轉換提供頻率為0.5 Hz,占空比為50%的脈沖方波,經過LM358放大,用來控制低壓MOS場效應管2N7002的通斷。

遠處轉移一直是治療骨肉瘤的主要難題,其機制涉及腫瘤細胞的遷移、侵襲、上皮間質轉化等過程[22,23]。多項研究發現高SOX4水平與腫瘤復發、遠處轉移、侵襲性和血管生成之間存在相關性[24,25]。本研究結果顯示,敲低SOX4顯著抑制了骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力。MMP2、MMP9和Fibronectin 1均是與惡性腫瘤轉移相關的基因。MMP-2 和MMP-9 是基質金屬蛋白酶(MMPs)家族的成員,也是目前為止發現的與腫瘤轉移最為密切的細胞外基質降解酶[26]。MMP-9具有調節微循環和血管生成的作用,其可通過促進血管內皮生長因子VEGF的表達來促進血管生成,從而導致惡性腫瘤的高轉移性。Fibronectin 1是一種廣泛存在于多種組織和細胞中的高分子糖蛋白,具有調控細胞遷移、黏附及組織修復的功能,Fibronectin 1可通過與多種整合素結合來增加腫瘤細胞的侵襲性[27]。本研究結果顯示,敲低SOX4顯著下調了骨肉瘤細胞中的MMP2、MMP9和Fibronectin 1蛋白表達。上述結果提示敲低SOX4對骨肉瘤腫瘤轉移的抑制作用可能通過MMP2、MMP9和Fibronectin 1來介導。

本研究通過體外異種移植腫瘤模型實驗證實了敲低SOX4對腫瘤生長的抑制作用。總之,本研究表明SOX4在骨肉瘤患者中異常高表達,并且與不良預后有關。抑制SOX4的表達可抑制腫瘤細胞的增殖和轉移能力,并誘導細胞凋亡。靶向抑制SOX4有望成為骨肉瘤治療的新療法。