右美托咪定預處理對膿毒癥相關性腦病大鼠中樞及外周炎性反應的保護作用

張春芳，鄒平洋，蘇 娜，陸曉勤，劉先保(廣州醫科大學附屬第三醫院婦產科，廣州 5050；廣州醫科大學附屬第三醫院麻醉科；九江市第一人民醫院麻醉科;通訊作者,E-mail:4576589@qq.com)

右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一種高選擇性α2腎上腺能受體激動劑,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用。近幾年在臨床麻醉中應用非常廣泛,發現可以減少術后認知功能障礙[1],動物實驗通過右美托咪定減輕海馬炎癥防治老年大鼠術后認知功能障礙[2]。右美托咪定可能通過作用外周和中樞神經系統交感神經,減少細胞因子和趨化因子釋放作用[3,4]。近年研究發現[5-8],右美托咪定還具有腦、心臟、肺和腎等多種重要器官保護作用,并且能發揮明顯的全身抗炎效應。Chu等[9]在研究辣椒素對脂多糖刺激小鼠腹腔巨噬細胞產生炎癥分子的影響中發現NF-κB/IκB參與調節LPS誘導巨噬細胞炎癥因子釋放,可以調節COX-2,iNOS,IκB-α, VR-1表達。而Zhai等[10]發現右美托咪定通過HMGB1/TLR4/NF-κB傳導通路對腦缺血再灌注大鼠腦損傷產生神經保護作用。LPS誘導炎癥釋放過程中,右美托咪定是否通過NF-κB/IκB傳導通路調節炎癥釋放產生神經保護作用?基于此,本研究根據文獻[11]選擇脂多糖制備膿毒癥相關性腦病大鼠模型,觀察右美托咪定對膿毒癥大鼠外周及中樞炎性反應的保護作用,探索右美托咪定在膿毒癥相關性腦病大鼠的神經保護作用機制,為膿毒癥相關性腦病患者臨床治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料及分組

右美托咪定(批號:H20090248,江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)、LPS(批號:L2880美國Sigma公司)、IκB、NF-κB、TNF-α、IL-1、iNOS、COX-2(批號ab32518,ab16502,ab6671,ab9722, ab15323, ab15191,Abcma公司),TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10(批號:CSB-E11987r,CSB-E08055r,CSB-E04640r,CSB-E04595r,華美公司)。實驗分4組:對照組(NC組)、LPS組、DEX干預組和DMSO組。40只雌性SD大鼠,按隨機數字法分組,每組10只。NC組腹腔注射生理鹽水1 ml,LPS組腹腔注射LPS(10 mg/kg,稀釋到1 ml);DEX組在給LPS前30 min注射右美托咪定(100 μg/kg)提前干預;DMSO組腹腔注射2%DMSO 1 ml。

1.2 模型建立[11]

健康雌性SPF級SD大鼠,10周齡,體質量220-250 g,由廣東省實驗動物中心提供(許可證號SCXK(粵)2013-0002,實驗動物質量合格證440072000028425)。飼養于18-25 ℃環境中,自由飲食、攝水,飼養1周適應環境進行造模。固定大鼠,腹腔單次注射LPS(10 mg/kg,稀釋到1 ml),放入籠中觀察大鼠行為學變化,出現稀便,尿液顏色及氣味改變,呼吸頻率變快,幅度減小等表現,抽外周血檢測血清S100β升高,即認為LPS致大鼠膿毒癥相關性腦病模型建立成功[12]。腹腔注射LPS造模后6 h采用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉后快速取新鮮血漿和大腦海馬組織,血漿行ELISA檢測,海馬組織行Western blot和RT-qPCR檢測。

1.3 檢測方法

1.3.1 ELISA法檢測TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10 具體步驟:①包被:用0.01 mol/L的包被液將檢測抗體稀釋至濃度為1-10 μg/ml。96孔板中每孔加0.1 ml,在4 ℃過夜孵育。次日吸去加樣孔的孵育液體。②加樣:37 ℃孵1 h洗滌。③加酶標抗體:加入新鮮稀釋的酶標抗體0.1 ml于加樣孔中。37 ℃孵育0.5-1 h,洗滌。④加底物液顯色:將0.1 ml新鮮配制的TMB 底物溶液加入加樣孔,37 ℃孵育10-30 min。⑤終止反應:將2 mol/L的0.05 ml硫酸加入加樣孔中。⑥OD值測定。

1.3.2 Western blot蛋白印跡檢測NF-κB、IκB、iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1 具體步驟:①海馬組織蛋白提取:稱組織放入勻漿器;加入300 μl預冷蛋白裂解液,冰上操作,勻漿器勻漿大約30下;移出勻漿液1.5 ml到EP管,10 000 r/min 4 ℃離心5 min;取少量上清液BCA方法檢測蛋白濃度,取上清液至新的EP管;加入5×loading buffer,煮沸樣品,-20 ℃保存備用。②安裝SDS-PAGE電泳膠板模型,配置分離膠溶液,制備濃縮膠,將凝膠模板放入電泳槽上固定好,依次上樣。開始時電壓設置100 V,待染料濃縮成一條線開始進入分離膠后,將電壓設置130 V,完成后斷開電源。③轉膜,抗體孵育,曝光顯影。

1.3.3 RT-qPCR基因檢測NF-κB mRNA 具體步驟:RNA逆轉錄步驟、冰上配制反應體系、混勻反應體系,37 ℃反應1 h、反應完后放冰上備用。反應條件:使用ViiA7 software 95 ℃ 30 s;95 ℃ 3 s,60 ℃ 34 s(收集熒光信號);45個循環。融解曲線分析:溫度60-95 ℃,每分鐘讀1次。引物設計:NF-κB引物 F:CAACGGGTAAACTTGTCCCT,R:TTGAACAGCTGGCATAGTCC;GAPDH序列F:ACTAACCCTGCGCTCCTG,R:CCCAATACGACCAAATCAGA。

1.4 統計學方法

應用SPSS19.0軟件進行統計學分析,計量資料運用均數±標準差進行統計描述,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ELISA法檢測結果

與NC組比較,DMSO組各指標差異無統計學意義(P>0.05),LPS組和DEX組外周血清TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10表達差異有統計學意義(P<0.05)。與DMSO組比較,LPS組和DEX組TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10表達差異有統計學意義;與LPS組比較,DEX組TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10表達差異有統計學意義(P<0.05,見表1)。

2.2 Western blot蛋白印跡檢測結果

與NC組比較,DMSO組各指標差異無統計學意義(P>0.05),LPS組和DEX組海馬組織TNF-α、IL-1、iNOS、COX-2及IκB表達差異有統計學意義(P<0.05)。與DMSO組比較, LPS組和DEX組TNF-α、IL-1、iNOS、COX-2及IκB表達差異有統計學意義(P<0.05);與LPS組比較,DEX組TNF-α、IL-1、iNOS、COX-2及IκB表達差異有統計學意義(P<0.05,見表2,圖1)。

與NC組比較,*P<0.05; 與DMSO組比較,#P<0.05;與LPS組比,&P<0.05

表2 Western blot檢測海馬組織IκB、TNF-α、IL-1、iNOS、COX-2表達 (n=10)Table 2 Expression of IκB,TNF-α,IL-1,iNOS, and COX-2 in hippocampus using Western blot (n=10)

與NC組比較,*P<0.05;與DMSO組比較,#P<0.05;與LPS組比,&P<0.05

圖1 海馬組織IκB、TNF-α、IL-1、iNOS和COX-2 的蛋白表達Figure 1 The expression of IκB,TNF-α,IL-1,iNOS and COX-2 in hippocampus by Western blot

2.3 RT-qPCR基因檢測結果

與NC組比較,DMSO組NF-κB mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05),LPS組和DEX組NF-κB mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05)。與LPS組比較,DEX組NF-κB mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05,見表3)。

表3 RT-qPCR檢測海馬組織NF-κB mRNA表達(n=10)Table 3 Expression of NF-κB mRNA in hippocampus using RT-qPCR (n=10)

與NC組比較,*P<0.05;與DMSO組比較,#P<0.05,與LPS組比,&P<0.05

3 討論

膿毒癥相關性腦病(SAE)是指缺乏臨床或實驗室證據的中樞神經系統感染, 由全身炎性反應引起的彌散性腦功能障礙,是全身炎癥反應所致的彌漫性大腦功能障礙和意識改變,主要病理生理為神經元細胞變性壞死,同時伴有白細胞浸潤、星型膠質細胞和小膠質細胞激活,級聯產生及多種炎性因子、自由基。因此,LPS介導的膿毒性腦病是多種炎癥細胞和多種細胞因子參與的機體全身炎癥反應綜合征與代償性抗炎反應綜合征之間平衡失調而誘發的中樞炎性疾病。

本研究通過腹腔注射LPS建立膿毒癥腦病動物模型,觀察全身炎癥水平和海馬組織炎癥因子基因表達及其含量,可見外周血促炎因子(TNF-α、NO、IL-1、IL-6)和抗炎因子(IL-10)水平變化。具體研究結果顯示,與NC組比較,LPS組外周血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10表達顯著上升。與LPS組比較,DEX組TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10表達顯著下降。有研究發現[13],DEX通過降低M1標記基因如TNF-α,IL-1β和IL-6的表達而發揮強效抗炎作用。重要的是,DEX改善了小膠質細胞M2標記物精氨酸酶-1(Arg-1),抵抗素樣分子(Fizz-1)和CD206的表達,還增強了Akt通路的激活。在中等劑量和高劑量下用DEX預處理導致IL-1,IL-6,TNF-α和PGE2表達的明顯下調,以及IL-2水平的上調。文獻資料結果與本研究結果基本一致,也彌補了本研究只選用一個高劑量的缺陷(100 μg/kg)。腹腔注射DEX對膿毒癥腦病動物模型外周炎癥有明顯改善作用,右美托咪定可以調節膿毒癥腦病大鼠外周血TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10的表達。我們的研究結果提示,右美托咪定預處理可改善膿毒癥腦病大鼠外周炎性因子釋放。也有很多研究者發現右美托咪定這種抑制炎癥因子的釋放,起到了保護器官功能的作用,同時也發現右美托咪定抑制炎癥因子的釋放可能有多種機制參與,調節炎癥因子釋放可能涉及到自噬、MAPK、TRL-4/NF-κB等傳導通路[14,15],NF-κB在調節炎癥釋放中可能起到重要作用。

本研究進一步探索右美托咪定在LPS誘導膿毒癥相關性腦病大鼠中抑制炎癥釋放的作用機制,觀察到海馬組織中TNF-α、IL-1、iNOS、COX-2及NF-κB mRNA表達顯著上升,IκB表達顯著下降,TNF-α、IL-1、iNOS表達與外周血中表達呈正相關性。右美托咪定干預后,TNF-α、IL-1、iNOS下調,與外周血清相關指標變化一致,提示外周與中樞存在某種關聯。本研究還發現LPS組海馬組織NF-κB mRNA表達顯著下降,IκB表達顯著上升,右美托咪定干預后可以調節其表達水平。所以NF-κB、IκB與外周血促炎因子和抗炎因子釋放有著密切的關系。這一點也有研究證實[16],暴露LPS大鼠有顯著的認知功能障礙,用LPS處理的大鼠血清和海馬勻漿中TNF-α和IL-6的水平明顯增加。DEX預處理可以減少LPS暴露導致TNF-α,IL-6和NF-κB表達。LPS暴露,NF-κB阻斷劑PDTC預處理抑制了促炎細胞因子(TNF-α和IL-6)的產生。DEX聯合PDTC應用比單純LPS暴露治療的TNF-α和IL-6表達更低。PDTC和DEX聯合應用效果更佳明顯。 Zhang等[17]研究結果表明,在LPS誘導的認知功能障礙模型中,DEX通過NF-κB發揮神經保護作用。我們的結果也顯示,LPS暴露膿毒癥相關性腦病大鼠海馬組織中,右美托咪定干預后可以導致NF-κB mRNA表達顯著下降,IκB表達顯著上升。根據我們研究結果及近期研究文獻顯示,右美托咪定能夠抑制外周及中樞炎癥因子的釋放,可能是通過NF-κB/IκB信號通路來調節外周及中樞炎癥而發揮作用,從而發揮了神經保護作用。

本研究也存在一些不足之處,所以獲得的結果也存在一定局限性,比如本研究未選取多個時間點采集標本動態檢測外周及中樞相關的指標,未采用不同劑量的右美托咪定對膿毒癥相關性腦病大鼠進行干預,未探討是否存在劑量依賴性。由于經費問題,未采用多種檢測方法檢測外周及海馬組織核心轉錄因子(NF-κB)、IκB以及炎癥因子,下一步將繼續深入研究右美托咪定在外周及中樞炎癥神經保護作用機制。