民族理筋手法對大鼠運動性骨骼肌損傷血清標志物影響的研究

李彥雙，馬惠昇，穆 靜，史 歡，李嫚嫚，桑 濤，宋毛毛

（寧夏醫科大學中醫學院，寧夏 銀川750004）

運動性骨骼肌損傷（Exercise-induced muscle damage，EIMD）是指機體維持或長期從事不習慣、高強度運動后發生的骨骼肌纖維微細損傷，常發生在離心運動后［1］。機體在大負荷高強度的離心運動后，骨骼肌纖維會產生超細微結構改變，導致肌細胞膜損傷。血清肌酸激酶（Creatine kinase，CK）和乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）等肌肉蛋白酶因為運動導致的骨骼肌細胞膜損傷，使膜通透性增大而由細胞內進入血液。所以這些肌肉蛋白酶在血液中濃度增加意味著骨骼肌細胞膜損傷或通透性增加，間接提示肌肉存在某種程度的損傷。EIMD 是骨骼肌結構和機能重建、提高機體運動能力的必要過程，但延遲性的損傷會造成不同程度的肌肉酸痛、運動能力下降及運動性疲勞等多種問題，若不及時治療，將進一步加劇運動損傷并造成慢性疼痛或損傷。因此，如何在骨骼肌損傷發生后找到一種較為快捷有效的治療手段，防治骨骼肌損傷后繼續惡化，提高肌肉損傷的

治愈率，縮短痊愈時間已經成為廣泛關注的問題。課題組前期經過大量臨床及實驗研究證實，回族理筋手法可疏通經絡、消腫止痛、放松肌肉、滑利關節，在骨骼肌損傷康復治療方面具有獨特療效［2-3］。本實驗擬通過理筋手法對大鼠骨骼肌運動性損傷后局部溫度、血清肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzyme，CK-MM）、乳酸脫氫酶及肌紅蛋白（myoglobin，Mb）含量變化的研究，觀察回族理筋手法對運動性骨骼肌損傷的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠63 只，8周齡，體質量（200±20）g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（寧）2015-0001。飼養環境維持溫度23 ℃～25 ℃，濕度55%～60%，每小時換風16 次，12 h 光照/12 h 黑暗自動控制循環光照條件。

1.1.2 試劑與儀器 血清CK、LDH 及Mb 試劑盒購于武漢基因美生物科技有限公司。紅外線熱成像儀，美國Meditherm 公司，型號MED2000IRIS7；酶標儀，芬蘭Labsystems Multiskan MS 公司產品，型號352 型；洗板機，芬蘭Thermo Labsystems 公司產品，型號AC-8；國產微量高速離心機，型號TG16W；吉爾森P 型移液器（Pipetman）；隔水式恒溫培養箱，型號GNP-9080。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與處理 63 只SD 雄性大鼠適應性喂養5 d 后，隨機分為空白組、模型對照組、自然恢復組、治療組。空白組18 只正常飼養，不做任何處理，分別于造模結束后的第1 周末、第2 周末各處死9 只；模型對照組、自然恢復組和治療組均按照下述造模方法進行造模。模型對照組9 只于造模4 周結束后處死；自然恢復組18 只造模結束后不予任何干預手段，分別于造模結束后的第1 周末、第2 周末各處死9 只；治療組18 只造模結束后給予回族理筋手法治療，1 次/d，5～8 min/次，5 次/周，分別治療1 周、2 周后各處死9 只。每組大鼠在處死前均先在股四頭肌處拍攝紅外熱圖像并記錄下損傷局部溫度。

1.2.2 模型制備 在正式實驗前除空白組外，其余各組大鼠均在跑臺上進行2 d 適應性訓練：第1 天跑臺坡度0°，16 m/min，持續10 min；第2 天跑臺坡度0°，19 m/min，持續20 min。在適應訓練后間歇休息1 d，次日開始正式實驗。參照Armstrong RB等［4］的造模方法，模型組、自然恢復組和治療組大鼠均運用一次性跑臺建立運動性骨骼肌損傷模型，進行一次性持續下坡跑運動，具體的參數是：跑臺坡度-16°，速度19 m/min，運動持續時間120 min，120 min/d，5 天/周，共4 周。

1.2.3 回族理筋手法 根據《回回藥方》第34 卷“折傷門”筋傷相關理論，以及目前回族醫學臨床治療“慢性筋痛癥”使用頻率較高的常用手法，選取松筋、撥筋、順筋法3 種理筋手法。每天由專人操作，將大鼠固定于固定器上，在大鼠的股四頭肌處分別施以松筋、撥筋、順筋法。松筋：左手固定大鼠頭頸部，用右手拇指指腹自髂前下棘至脛骨粗隆之間進行輕柔有頻率地來回按揉，時間約為3 min。撥筋：用右手的拇指指腹與中、食指指腹進行操作，用中、食指固定輔助腿部，拇指指腹在股四頭肌處進行輕柔有頻率地橫向撥筋，時間為3 min。順筋：以右手拇指著力于股四頭肌處，順著肌肉的走向和經筋的循行進行有節律地推捋，時間2 min。

1.3 觀察指標

1.3.1 醫用紅外線熱成像儀檢查 采用醫用紅外線熱成像儀，結合Meditherm IRIS 7.5，Meditherm Display 軟件及計算機對圖片進行存儲及相關區域溫度測定和校對。該系統空間分辨率為1 mrd，測溫參數范圍為0～50°，在無空氣對流、無陽光直射的房間進行圖像采集，室溫設置在21 ℃左右，濕度為50%～60%。每組實驗動物在拍攝前用剃毛機剃除股四頭肌處毛發，充分暴露皮膚，不可損傷皮膚，安靜休息10 min；隨后用大鼠固定器固定大鼠，充分暴露無毛部分之后，使其距紅外線熱成像儀鏡頭1.5 m 處采集圖像信息，并記錄下圖像的紅色區域及白色區域的平均溫度。

1.3.2 標本采集 將大鼠稱重后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用心尖采血的方法收集血液5 mL 于離心管中，將血樣離心（4 ℃，3000 r/min，10 min）分離血清，取血清于Appendorf 管中，冷凍于-80 ℃冰箱中備用。采用酶聯免疫法檢測大鼠血清CK-MM、LDH、Mb 水平，實驗過程嚴格按照試劑盒上的說明方法進行。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件對實驗數據進行分析處理，結果以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-T檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

各組大鼠溫度及血清CK-MM、LDH、Mb 含量的比較見表1。從表1 可以看出，造模4 周結束后，模型對照組損傷局部溫度、血清CK-MM、LDH、Mb 水平均上升（P＜0.01）；治療組行回族理筋手法治療1 周后，各指標都有所降低P＜0.05）；自然恢復1 周組LDH 水平較模型組降低（P＜0.05），其他3 項指標無明顯變化（P＞0.05）；治療1 周組CKMM 與LDH 水平較自然恢復1 周組明顯下降（P＜0.05）；而治療2 周組除LDH 外，其余3 項指標均較自然恢復2 周組明顯下降（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 回族理筋手法與大鼠骨骼肌損傷后局部溫度變化之間的關系

目前，紅外熱成像技術在臨床應用較為廣泛。紅外線熱成像系統是以多數疾病都可以引起溫度場變化為依據，通過檢測身體表面溫度的差異，用可視化圖片來體現，再利用專屬計算機對信號進行分析與解讀，以機體不同部位的溫度來評估人體的寒熱變化。該技術具有測溫迅速、準確、客觀、靈敏的優點，且無痛苦，無刺激，無輻射，患者易于接受［5］，在臨床上對炎癥、腫瘤、周圍神經疾病及一些疑難病癥可做提示性診斷。本研究成功將該技術運用于動物實驗中，并為慢性運動性骨骼肌損傷模型的建立提供輔助性診斷。實驗結果表明，大鼠4 周跑臺造模結束后，選取股四頭肌處拍攝紅外熱像，該部位溫度明顯升高，說明經長期慢性運動后，大鼠股四頭肌處組織細胞結構或功能改變引發無菌性炎癥，導致局部被炎性物質浸潤，血流速度加快，局部溫度升高。

溫度是反應機體生理病理狀態的重要參數之一，紅外線熱成像技術可將病變組織與正常組織之間出現的溫差變化體現出來，從而為局部肌肉損傷提供間接性診斷。根據紅外線熱成像系統的皮溫測定結果，本實驗除空白組外，其余各組大鼠股四頭肌處溫度明顯升高。治療組施以回族理筋手法作用于股四頭肌處，在治療1 周、2 周后，股四頭肌處體表溫度明顯低于自然恢復組（P＜0.05），說明手法有助于促進局部無菌性炎癥的消退，改善局部血液循環，從而降低體表溫度。

3.2 回族理筋手法與大鼠血清損傷標志物之間的關系

機體中酶類多在細胞內合成，當骨骼肌發生微損傷時，細胞膜通透性改變，肌細胞中各種酶類入血，致使血清中酶活性升高，產生一系列化學效應，刺激神經末梢產生疼痛［6］。

肌酸激酶是血漿非功能性酶的一種，是由2個亞單位組成的二聚體，CK-MB 主要存在于心肌中，CK-MM 主要存在于骨骼肌中［7］。在骨骼肌中，CK 基因的表達大多是以CK-MM 形式存在的，其組織特異性較CK 能更準確地反映骨骼肌的機能狀態［8］。有研究發現，大運動耐力訓練后大鼠血清CK-MM 顯著增加，與正常組比較差異有統計學意義（P＜0.05）［9］。王瑛等［6］在對一次性力竭運動大鼠模型血清CK-MM 含量變化的研究中發現，模型組大鼠血清CK-MM 值持續上升，峰值出現在73 h，說明運動誘發骨骼肌損傷，致CK-MM 釋放入血，血中CK-MM 活性升高。劉沛潔等［10］通過4 周下坡跑建立慢性EIMD 大鼠模型，造模4 周后，大鼠血清CK-MM 含量顯著上升，在4 周造模結束后推拿組即刻給予推拿干預，CK-MM 值隨著恢復時間的延長而下降。本研究結果顯示，在慢性持續性下坡跑運動4 周時，模型對照組大鼠血清CK-MM 值明顯上升，說明長期的慢性運動已引起大鼠骨骼肌的損傷。治療組通過回族理筋手法治療1 周后，血清CK-MM 含量較自然恢復1 周組下降明顯；手法治療2 周，血清CK-MM 恢復至正常水平。說明回族理筋手法干預可以下調血清中CK-MM 的表達，同時能夠促進損傷肌組織的修復，并對骨骼肌運動機能起到一定的保護作用。

表1 各組大鼠溫度及血清CK-MM、LDH、Mb 含量的比較 （±s）

表1 各組大鼠溫度及血清CK-MM、LDH、Mb 含量的比較 （±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型對照組比較，2）P＜0.05；與自然恢復1 周組比較，3）P＜0.05；與自然恢復2 周組比較，4）P＜0.05

組別 n T（℃） CK-MM（ng/mL） LDH（ng/mL） Mb（pg/mL）空白1 周組 9 32.70±0.48 12.833±1.494 65.943±6.136 2886.426±140.681空白2 周組 9 32.68±0.50 13.074±1.858 64.172±5.929 2814.839±222.786模型對照組 9 34.71±0.431） 27.476±4.0481） 120.906±9.5871） 4472.034±526.4801）自然恢復1 周組 9 34.52±0.44 23.699±3.627 101.878±8.8852） 4064.570±246.318自然恢復2 周組 9 34.08±0.33 17.564±1.777 62.201±5.511 3108.083±205.009治療1 周組 9 34.27±0.352） 18.553±1.5042）3） 84.050±13.4522）3） 3854.715±190.5982）治療2 周組 9 33.67±0.442）4） 14.287±1.5882）4） 64.916±6.5762） 2844.253±279.0902）4）

乳酸脫氫酶（LDH）主要分布于心肌、骨骼肌、肝臟細胞中，是機體糖無氧代謝途徑的一種重要酶，為機體在缺氧狀態下運動時提供能量。當骨骼肌發生損傷時LDH 從細胞內溢出組織間液再進入血液，從而導致血清酶活性增加［11］。CK 和LDH 常用來評價運動性肌損傷時骨骼肌細胞膜通透性的改變。有研究顯示，持續時間離心運動后，大鼠血清LDH 的含量顯著上升［12］。馬新東等［13］通過一次性離心運動來觀察大鼠骨骼肌骨架蛋白的表達，發現運動后大鼠血清CK、LDH 濃度即刻顯著增加。本研究結果顯示，在慢性運動性骨骼肌損傷的過程中，大鼠血清LDH 水平顯著升高，與自然恢復1 周組比較，治療組經回族理筋手法治療1 周后，血清LDH 明顯下降（P＜0.05），說明運動結束后大鼠血清LDH 的變化隨著時間的增長逐漸下降，治療組在回族理筋手法的干預下，大鼠血清LDH 下降明顯，說明回族理筋手法可以抑制機體無氧代謝的進程，加快血清LDH 恢復至正常水平，從而促進骨骼肌損傷的修復。

Mb 主要存在于肌組織的肌漿中，含量約為0.2%～2%，是肌細胞中儲存氧的蛋白質。在持續性運動中會產生大量自由基，自由基的攻擊會使得肌細胞膜通透性增加，而Mb 的分子量較小，約為17.5kD，容易通過肌細胞膜進入血液中。大量研究表明，當運動引起的骨骼肌微損傷時，血中Mb 會顯著升高。李揚［14］研究發現，在大強度運動后，血清Mb 濃度隨著時間不斷增高，在24 h～48 h 之間增長幅度驟然增加，48 h 時達到峰值，此后逐漸恢復，但變化不明顯。而狄媛［15］發現在高強度運動中，運動員血清Mb 的最高值出現在運動后24 h。本實驗研究結果發現，在持續性4 周下坡跑運動結束后，模型組大鼠Mb 含量顯著上升，這是由于長期的運動損傷致使機體內自由基產生過多，導致肌細胞膜的通透性增加，Mb 通過肌細胞膜進入血液循環中，進而使得血清中Mb 含量增加。治療1 周組血清Mb 水平較自然恢復1 周組下降明顯，但Mb 水平仍高于正常；治療2 周后，恢復至正常水平，與自然恢復2 周組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。說明回族理筋手法可以抑制骨骼肌損傷過程中自由基的產生，使得肌細胞膜的通透性保持在正常狀態，因此血清中Mb 的含量會明顯下降。以上研究結果表明回族理筋手法可能通過調節外周血清標志物CK-MM、LDH 及Mb 的水平而降低受損肌組織的體表溫度。