四君子湯中總多糖、總黃酮和總皂苷的純化工藝研究

劉 培，王伊楠，張莉丹，董征艷，王 科，郭宇航，王鵬飛，段秀俊

（山西中醫藥大學，山西 晉中030619）

四君子湯又名白術湯，源于宋代《太平惠民和劑局方》［1］，其組成包括人參、白術、茯苓、甘草四味中藥，臨床上常用黨參代替人參。黨參性甘，為君藥，具有補脾養胃、生津益氣之效；白術甘苦性溫，為臣藥，可助君藥燥濕健脾、益氣助運；茯苓甘淡性平，為佐藥，具有滲濕健脾的功效；甘草甘淡，為使藥，可用于調和諸藥，和中益氣［2］。四藥相輔相成，具有益氣補中、健脾養胃的作用，能夠調節胃腸道功能、促進消化吸收、增強機體免疫力、抗衰老及促進癌細胞凋亡，現臨床多用于治療慢性胃炎、胃潰瘍、功能性消化不良、慢性腹瀉、潰瘍性結腸炎等胃腸道疾病。四君子湯水煎液中主要含有黃酮類、皂苷類、多糖等成分，還包括一些生物堿類和揮發油［3-6］，這些有效成分相輔相成，共同作用。有文獻報道四君子湯中的多糖類、黃酮類、皂苷類為其有效成分，但并沒有關于四君子湯中總多糖、總黃酮和總皂苷成分提取純化的研究報道。因此，本文對回流水提取的四君子湯進一步純化，采用單因素與正交試驗相結合的方法，優選總多糖、總黃酮及總皂苷的最佳純化工藝，為四君子湯的進一步研究提供理論基礎。

1 實驗材料

1.1 藥材與試劑

黨參為桔?？浦参稂h參的干燥根（批號：180102），白術為菊科植物白術的干燥根莖（批號：180101），茯苓為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核（批號：180302），均購自山西維康堂中藥飲片有限公司；甘草為豆科植物甘草的干燥根和根狀莖（批號：141147），購自河北亞寶藥業有限公司，由山西中醫藥大學段秀俊副教授鑒定為正品；D-葡萄糖標準品（批號：110833-201205），蘆丁標準品（批號：100080-200707），苷草酸標準品（批號：181006），購于中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇、苯酚、濃硫酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氨水、正丁醇、香草醛、乙酸、高氯酸等試劑均為分析純，水為哇哈哈純凈水。

1.2 實驗儀器

UV-6100S 紫外-可見分光光度計（上海元析儀器責任有限公司），AUW120D 電子天平（島津），SK-101 數顯鼓風干燥箱（上海圣科儀器設備有限公司），SHB-Ⅲ循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司），SY-2000 旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠），KQ5200V 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HH-2 數顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司），ZNHW-II 智能恒溫電熱套（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

2 方法與結果

2.1 四君子湯中總多糖的純化工藝優選

2.1.1 四君子湯中總多糖含量測定方法的建立

2.1.1.1 四君子湯飲片干浸膏的制備 稱取干燥的黨參9 g，茯苓9 g，白術9 g，甘草6 g，加10 倍量的水100 ℃水浴回流1 h，過濾，濾渣加8 倍量水100 ℃水浴回流45 min，合并2 次濾液，減壓濃縮，待冷卻后加入乙醇使藥液含醇量為75%，于4 ℃的冰箱中靜置，取出濾過，濾液回收乙醇，濾渣加水溶解，于70 ℃烘干。

2.1.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取D-葡萄糖標準品15.26 mg，至10 mL 容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，得濃度為1.5260 mg/mL 的D-葡萄糖標準品母溶液。再取D-葡萄糖標準品母溶液1 mL 稀釋至5 mL，得0.305 2 mg/mL 的D-葡萄糖標準品溶液。

2.1.1.3 供試品溶液的制備 取按“2.1.1.1”項下制備的四君子湯飲片干浸膏0.1 g，精密稱定，置100 mL 圓底瓶中，加水50 mL，100 ℃回流60 min，放至室溫，加水補足減失的質量，濾過，精密移取20 mL 于50 mL 圓底燒瓶中，減壓濃縮后，置于10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，再取1 mL加水稀釋至5 mL，即得。

2.1.1.4 苯酚-濃硫酸比色法測定四君子湯中總多糖含量 精密吸取供試品溶液0.8 mL 于具塞試管，加水至1 mL，加入5%苯酚1 mL，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冷水浴中降至室溫后，置沸水浴加熱15 min，再置于冷水浴中降至室溫，隨行作空白對照，于490 nm 測吸光度［7］。

2.1.2 四君子湯中總多糖純化工藝的單因素考察

2.1.2.1 醇沉濃度對總多糖提取量的影響 按“2.1.1.1”項下處理樣品，恒定濃縮至藥液比為1∶1，待冷卻后分別加入乙醇使藥液含醇量為65%、70%、75%、80%、85%，于冰箱中靜置12 h，按“2.1.1.3”項下制備供試品溶液，按“2.1.1.4”項下方法顯色并測定總多糖含量，結果總多糖提取含量分別為93.343 7 mg/g、91.227 9 mg/g、85.223 3 mg/g、98.693 4 mg/g、98.773 8 mg/g。結果表明，隨著醇濃度的變化，多糖含量在醇濃度為80%達到最高峰，所以實驗選擇醇濃度為80%。

2.1.2.2 濃縮密度對總多糖提取量的影響 按“2.1.1.1”項下處理樣品，分別濃縮至藥液比為1∶1.5、1∶1.25、1∶1、1∶0.75、1∶0.5，加入乙醇使藥液含醇量為75%，于冰箱中靜置12 h，按“2.1.1.3”項下制備供試品溶液，按“2.1.1.4”項下方法顯色并測定總多糖含量，得到的總多糖提取量分別為92.061 8 mg/g、93.721 1 mg/g、89.841 3 mg/g、90.004 2 mg/g、83.401 8 mg/g，結果表明多糖含量在濃縮密度為1∶1.25 時達到最高峰，所以實驗選擇濃縮密度為1∶1.25。

2.1.2.3 靜置時間對總多糖提取量的影響 按“2.1.1.1”項下處理樣品，分別濃縮至藥液比為1∶1，加入乙醇使藥液含醇量為75%，于冰箱中分別靜置1、3、6、12、18 h，按“2.1.1.3”項下制備供試品溶液，按“2.1.1.4”項下方法顯色并測定總多糖含量，得到總多糖提取量為80.089 8 mg/g、75.844 2 mg/g、80.480 9 mg/g、87.866 2 mg/g、83.340 8 mg/g。結果表明，隨著靜置時間的變化，多糖含量在靜置時間12 h 時達到最高峰，所以實驗選擇靜置時間12 h。

2.1.2.4 正交試驗考察 依據單因素試驗結果，確定三因素三水平：乙醇濃度A（75%、80%、85%），濃縮密度B（1∶1.5、1∶1.25、1∶1.00），靜置時間D（6 h、12 h、18 h）［8-10］。采用L9（34）正交表考察最佳純化工藝。正交試驗結果見表1，方差分析見表2。

表1 四君子湯中總多糖純化工藝正交試驗結果

表2 四君子湯中總多糖純化工藝方差分析

表3 驗證試驗結果 （mg/g）

由表1～2 可知，各因素對總多糖醇沉的影響順序為：醇濃度＞濃縮密度＞靜置時間。實際試驗最佳組合為A3B2D3，統計學最佳組合為A3B2D1，將此兩種方案做了3 次重復試驗，結果見表3。試驗結果無明顯差異，再加上D 為不顯著因素，從節時的角度確定A3B2D1為最佳組合，即醇濃度為85%，濃縮密度1∶1.25，靜置時間6 h。

2.2 四君子湯中總黃酮的純化工藝研究

2.2.1 四君子湯中總黃酮含量測定方法的建立

2.2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品5.45 mg，置5 mL 容量瓶中，加入適量的70%乙醇充分溶解后，定容至刻度，搖勻，得1.09 mg/mL 的蘆丁對照品溶液［11］。

2.2.1.2 供試品溶液的制備 取按“2.1.1.1”項下制備的四君子湯干浸膏0.2 g，精密稱定，用70%乙醇20 mL 超聲提取30 min，過濾，揮干溶劑，殘渣加70%乙醇定容至10 mL，即得［12-13］。

2.2.1.3 亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定四君子湯中總黃酮的顯色方法 精密量取“2.2.1.2”項下供試品溶液1 mL 至25 mL 容量瓶中，加水5 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，6 min 后加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，6 min 后加入10%的NaOH 溶液5 mL，蒸餾水定容，隨行做空白對照，10 min 后于510 nm 測定吸光度［12，14-15］。

2.2.2 四君子湯中總黃酮純化工藝的單因素考察

2.2.2.1 醇濃度對總黃酮提取量的影響 按“2.1.1.1”項下處理樣品，濃縮至藥液比為1∶1，加入乙醇使藥液含醇量分別為65%、70%、75%、80%、85%，靜置12 h，按“2.2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.2.1.3”項下方法顯色并測定總黃酮含量，計算總黃酮提取量，結果分別為15.092 mg/g、15.921 mg/g、15.518 mg/g、16.983 mg/g、16.347 mg/g。結果表明，含醇濃度為80%時，藥材中總黃酮的含量達到峰值，故試驗選擇藥液含醇量為80%。

2.2.2.2 濃縮密度對總黃酮提取量的影響 按“2.1.1.1”項下處理樣品，分別濃縮至藥液比為1∶1.5、1∶1.25、1∶1、1∶0.75、1∶0.5，加入乙醇使藥液含醇量為75%，靜置12 h，按“2.2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.2.1.3”項下方法顯色并測定總黃酮含量，結果得到總黃酮提取量分別為20.526 mg/g、22.963 mg/g、20.169 mg/g、16.580 mg/g、14.947 mg/g。結果表明，總黃酮收率在濃縮密度為1∶1.25 時達到峰值，故試驗選擇濃縮密度為1.25 倍。

2.2.2.3 靜置時間對總黃酮提取量的影響 按“2.2.1.1”項下處理樣品，濃縮至藥液比為1∶1，加入乙醇使藥液含醇量為75%，于常溫分別靜置1 h、3 h、6 h、12 h、18 h，按“2.2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.2.1.3”項下方法顯色并測定總黃酮含量，計算總黃酮提取量，結果分別為20.361 mg/g、22.413 mg/g、19.623 mg/g、20.509 mg/g、16.614 mg/g。結果表明，總黃酮收率在靜置時間為3 h 時達到峰值，故試驗選擇靜置時間為3 h。

2.2.3 正交試驗考察 依據單因素實驗結果，確定三因素三水平：醇濃度A（75%、80%、85%），濃縮密度B（1∶1.5、1∶1.25、1∶1），靜置時間D（1 h、3 h、6 h）。采用L9（34）正交表考察最佳純化工藝。正交試驗結果見表4，方差分析見表5。

表4 四君子湯中總黃酮純化工藝正交試驗結果

表5 四君子湯中總黃酮純化工藝方差分析

表6 驗證試驗結果 （mg/g）

由表4～5 可知，各因素對總黃酮提取率的影響順序為：濃縮密度＞靜置時間＞醇濃度。由表4可知：實際試驗結果可知最佳純化工藝為A1B3D3，統計學最佳組合為A1B2D3，將此兩種方案做了重復試驗3 次，試驗結果見表6。試驗結果總黃酮含量無明顯差異，從節省能源、節約資源的角度考慮，最終選擇最佳提取純化工藝為A1B3D3，即用75%乙醇、濃縮至1∶1、靜置6 h。

2.3 四君子湯中總皂苷的純化工藝研究

2.3.1 四君子湯中總皂苷含量測定方法的建立

2.3.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取甘草酸對照品12.01 mg，置2 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解后，定容至刻度，搖勻，得6 mg/mL 的甘草酸對照品母溶液。再取甘草酸對照品母溶液1 mL 稀釋至10 mL，得0.6 mg/mL 的甘草酸對照品溶液。

2.3.1.2 供試品溶液的制備 精密稱定“2.1.1.1”項下四君子湯飲片干浸膏0.1 g，用20 mL 蒸餾水超聲提取20 min，加20 mL 乙醚進行脫脂2 次，取水層置分液漏斗中用水飽和的正丁醇50 mL進行萃取，共4 次，收集正丁醇液，加2 倍5%氨水試液洗滌2 次，再用水飽和的正丁醇溶液洗滌3 次，每次100 mL。揮干正丁醇并用甲醇定容至5 mL 容量瓶中，過濾，從續濾液中移取1 mL，置10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻后，即得［14］。

2.3.1.3 1%香草醛乙酸-高氯酸比色法測定四君子湯中總皂苷的含量 精密量取供試品溶液1 mL于10 mL 具塞刻度試管中，水浴揮干甲醇，冷卻后準確加入1%香草醛乙酸-高氯酸溶液（2∶8）0.5 mL，立即搖勻，60 ℃恒溫水浴上充分混勻后加熱15 min，取出，立即冰浴冷卻后，準確加入77%的硫酸溶液5 mL，搖勻。隨行做空白對照，于43 7nm 測吸光度［15-16］。

2.3.2 四君子湯中總皂苷純化工藝的單因素考察

2.3.2.1 醇濃度對總皂苷提取量的影響按“2.1.1.1”項下處理樣品，濃縮至藥液比為1∶1，加入乙醇使藥液含醇量為65%、70%、75%、80%、85%，于冰箱中靜置12 h，按“2.3.1.2”制備供試品溶液，按“2.3.1.3”項下方法顯色并測定總皂苷含量，得到總皂苷提取量依次為8.242 mg/g、8.389 mg/g、9.163 mg/g、9.495 mg/g、9.277 mg/g。結果表明，藥液含醇量為80%時，總皂苷含量達到峰值，故選擇醇濃度為80%。

2.3.2.2 濃縮密度對總皂苷提取量的影響 按“2.1.1.1”項下處理樣品，分別濃縮至藥液比為1∶1.5、1∶1.25、1∶1、1∶0.75、1∶0.5，乙醇使藥液含醇量為75%，于冰箱中靜置12 h，按“2.3.1.2”制備供試品溶液，按“2.3.1.3”項下方法顯色并測定總皂苷含量，計算總皂苷提取量依次為9.274 mg/g、10.596 mg/g、9.207 mg/g、7.570 mg/g、6.884 mg/g。結果表明，濃縮密度為1∶1.25 時，總皂苷含量達到峰值，故試驗選擇濃縮密度為1.25 倍。

2.3.2.3 靜置時間對總皂苷提取量的影響 按“2.1.1.1”項下處理樣品，濃縮至藥液比為1∶1，乙醇使藥液含醇量為75%，于冰箱中分別靜置1、3、6、12、18 h，按“2.3.1.2”制備供試品溶液，按“2.3.1.3”項下方法顯色并測定總皂苷含量，計算總皂苷提取量依次 為9.479 mg/g、10.068 mg/g、9.199 mg/g、9.309 mg/g、7.586 mg/g。結果表明，當靜置時間為3 h 的時候總皂苷的含量最大，故試驗選擇靜置時間為3 h。

2.3.3 正交試驗考察 依據單因素試驗結果，確定三因素三水平：醇濃度A（75%、80%、85%）、濃縮密度B（1∶1.5、1∶1.25、1∶1）和靜置時間D（1 h、3 h、6 h），采用L9（34）正交表考察最佳提取工藝。正交試驗結果見表7，方差分析見表8。

由表7～8 可知，A、B、C、D 均為不顯著因素（P＞0.05）。影響四君子湯中總皂苷含量的因素順序為濃縮密度＞醇濃度＞靜置時間。實際試驗最佳組合為A3B3C2D1，統計學最佳組合為A3B3D3，將此兩種方案做了重復試驗3 次，結果見表9。試驗確定A3B3D3為最佳組合，即醇濃度為85%，濃縮密度1∶1，靜置時間6 h。

3 討 論

本試驗以四君子湯中總多糖、總黃酮和總皂苷的含量為指標，考察了不同醇沉條件對四君子湯中總多糖、總黃酮及總皂苷提取量的影響，并優選出最佳純化工藝，為進一步研究四君子湯中的化學成分提供理論基礎。

表7 四君子湯中總皂苷純化工藝正交試驗結果

表8 四君子湯中總皂苷純化工藝方差分析

表9 驗證試驗結果 （mg/g）