片球菌素的來源、生物合成、抑菌機(jī)理及其構(gòu)效關(guān)系的研究進(jìn)展

王祺，張軍，喬曉妮，何增國(guó),2*

1(中國(guó)海洋大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院，山東 青島，266003) 2(青島百奧安泰生物科技有限公司，山東 青島，266100)

李斯特菌(Listeriaspp.)是一種導(dǎo)致食物腐敗變質(zhì)的常見微生物[1]。其中，單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)更會(huì)引起動(dòng)物和人類的疾病[2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，4%～8%的水產(chǎn)品、5%～10%的乳及乳制品以及30%以上的肉類被李斯特菌污染[3]。人和動(dòng)物誤食被該菌污染的食品后，會(huì)引起嚴(yán)重的食物中毒[4]。據(jù)報(bào)道，美國(guó)每年有1600多例單核增生李斯特菌感染人的病例，死亡率高達(dá)12.5%[5]。雖然四環(huán)素、甲氧芐啶和青霉素對(duì)治療單核增生李斯特菌中毒的效果顯著，但在食品工業(yè)中，仍然缺乏安全防止單核增生李斯特菌污染的有效手段[6]。

細(xì)菌素是一種來源于細(xì)菌的由核糖體合成具有抗菌功能的小肽，因具有安全性高、穩(wěn)定性好、無殘留等特點(diǎn)，在食品防腐領(lǐng)域日益受到關(guān)注[7]。乳酸菌是公認(rèn)安全的(generally recognized as safe，GRAS)益生菌，其產(chǎn)生的細(xì)菌素更成為了食品防腐領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8]。其中，乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis)代謝產(chǎn)生的細(xì)菌素——乳酸鏈球菌素(nisin)可有效地抑制腐敗菌的生長(zhǎng)、延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，已經(jīng)在食品防腐領(lǐng)域應(yīng)用達(dá)半個(gè)多世紀(jì)[9]。細(xì)菌素按照結(jié)構(gòu)、分子量、熱穩(wěn)定性以及是否經(jīng)過翻譯后修飾等特點(diǎn)，主要分為3類(表1)。其中，IIa類細(xì)菌素也稱類片球菌素，具有強(qiáng)烈的抗李斯特菌活性[10]，其中以片球菌素(pediocin)最具代表性。片球菌素具有良好的熱穩(wěn)定性和廣泛的pH適應(yīng)性，能夠滿足苛刻的食品加工環(huán)境，因此在食品防腐領(lǐng)域，特別是防止李斯特菌污染方面，成為了繼nisin之后，細(xì)菌素研究領(lǐng)域又一熱點(diǎn)[11]。

表1 細(xì)菌素的分類Table 1 Classification of bacteriocins

1 片球菌素的來源及序列特征

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的片球菌素共18個(gè)(表2)，來源包括：乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceous)和有害片球菌(Pediococcusdamnosus)。片球菌素分子質(zhì)量一般在2～10 kDa之間，其序列中氨基酸殘基數(shù)量差異較大，從37～48個(gè)不等(除前導(dǎo)肽外)，但其序列中均含有4個(gè)Cys，形成2對(duì)二硫鍵。如表2所示，片球菌素序列的凈電荷數(shù)均為正值，這與其發(fā)揮抑菌功能直接相關(guān)。片球菌素一般在微克級(jí)別均有抑菌活性，且均表現(xiàn)出對(duì)單核增生李斯特菌具有強(qiáng)烈的抑制作用。

表2 片球菌素的種類及序列特征Table 2 Types and sequence characteristics of pediocin

續(xù)表2

名稱來源氨基酸殘基個(gè)數(shù)序列特征凈電荷數(shù)敏感菌最小抑菌濃度分子質(zhì)量/kDa參考文獻(xiàn)pediocin 5Pediococcus acidi-lactici UL5-----[21]pediocin CP2Pediococcus acidi-lactici MTCC 5101---Listeria monocytogenesPseudomonas aeruginosa-3[22]pediocinPediococcus acidi-lactici 13-----5.5[23]pediocin JDPediococcus acidi-lactici JD123---Listeria monocytogenes--[24]pediocin PCPediococcus acidi-lactici PC---Listeria monocytogenes--[25]pediocinNCDC252Pediococcus acidi-lactici NCDC252--Listeria monocytogenesStaphylococcus aureus--[26]pediocinCFR B19Pediococcus pen-tosaceus CFR B19---Listeria monocytogenes-4.8[27]pediocin ST65ACCPediococcus pen-tosaceus ST65ACC---Listeria monocytogenes--[28]pediocinPP-SIIIPediococcus pen-tosaceus CFR SIII---Listeria monocytogenesSalmonella paratyphiStaphylococcus aureus-5[29]

2 片球菌素的生物合成

片球菌素的合成基因由質(zhì)粒編碼，其合成和分泌相關(guān)的4個(gè)基因位于同一操縱子[30]，包括：(1)結(jié)構(gòu)基因(structural genes)，用于編碼片球菌素前體；(2)免疫基因(immunity genes)，用于編碼保護(hù)片球菌素產(chǎn)生菌免受其自身殺死的免疫蛋白；(3)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)基因(ATP-bindingcassette transporter system genes)，用于編碼與細(xì)胞膜相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)，該系統(tǒng)將片球菌素轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，同時(shí)去除片球菌素前體的前導(dǎo)序列；(4)輔助蛋白基因(accessory protein genes)，用于編碼片球菌素分泌所必需的輔助蛋白。

與眾多細(xì)菌素的合成類似，片球菌素的生物合成同樣受群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)調(diào)控，主要表現(xiàn)在細(xì)菌素表達(dá)量與細(xì)胞密度或環(huán)境壓力正相關(guān)[31]。這一過程受3組分系統(tǒng)調(diào)控[7]，即(1)誘導(dǎo)因子(inducer factor, IF)；(2)膜組氨酸蛋白激酶(member histidine protein kinase, MHK)；(3)響應(yīng)調(diào)節(jié)因子(response regulator, RR)。首先，IF在基礎(chǔ)水平上進(jìn)行組成型表達(dá)，并通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)分泌到細(xì)胞外，當(dāng)釋放到細(xì)胞外的IF濃度足夠高時(shí)，會(huì)結(jié)合到跨膜的MHK上，使其位于細(xì)胞質(zhì)一側(cè)自磷酸化。之后，這個(gè)磷酸基被轉(zhuǎn)移到RR，并激活RR。最后，活化的RR與片球菌素結(jié)構(gòu)基因上的啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)片球菌素基因的表達(dá)。其中，IF在片球菌素生物合成過程作為正反饋因子，促進(jìn)其自動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制(圖1)。

圖1 片球菌素的生物合成示意圖(ChemBioDraw Ultra 14.0軟件繪制) Fig.1 Schematic diagram of biosynthesis of pediocin(drawed by ChemBioDraw Ultra 14.0)

片球菌素基因表達(dá)的特點(diǎn)主要在于其N端有一段前導(dǎo)肽。該前導(dǎo)肽可使片球菌素前體與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)有效互作。然后，在成熟的片球菌素分泌到胞外前，前導(dǎo)肽在細(xì)胞質(zhì)側(cè)被ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)的附屬蛋白降解。此外，與其他細(xì)菌素的前體通常不具活性相比，連接前導(dǎo)肽片段的片球菌素前體具有明顯的抑菌活性[32]。因此，為了避免片球菌素對(duì)產(chǎn)生菌的抑制作用，片球菌素合成后會(huì)被迅速運(yùn)輸?shù)桨?圖1)。然而，前導(dǎo)肽的作用僅為輔助片球菌素分泌，對(duì)結(jié)構(gòu)域的形成和抑菌功能的實(shí)現(xiàn)并沒有作用。RAY等[32]將pediocin AcH前體肽和成熟肽分別進(jìn)行異源表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pediocin AcH前體肽的抑菌活性約為成熟肽的80%，這表明前導(dǎo)肽對(duì)pediocin AcH成熟結(jié)構(gòu)域的形成和抑菌作用幾乎沒有影響。

3 片球菌素的抑菌機(jī)理

3.1 正確構(gòu)象的形成

分泌到細(xì)胞外的片球菌素需要在特定環(huán)境條件下才能形成正確構(gòu)型。研究發(fā)現(xiàn)，類片球菌素sakacin P在水或二甲基亞砜溶液中均以無規(guī)卷曲存在，不能正確折疊[33]。片球菌素正確折疊通常依賴于細(xì)胞膜或與細(xì)胞膜類似的環(huán)境。CASTANHO等[34]利用十二烷基磷酸膽堿(DPC)膠束和三氟乙醇(TFE)溶液模擬細(xì)胞膜環(huán)境，使用核磁共振波譜法分析2種類片球菌素在該環(huán)境下的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，N端形成含有二硫鍵的三股反平行β-折疊，同時(shí)C末端折回至中心α-螺旋上，形成含有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的正確構(gòu)型。這種受細(xì)胞膜或類細(xì)胞膜環(huán)境催化的折疊方式，拉近了帶正電荷氨基酸殘基的空間位置，為細(xì)菌素更好的與靶細(xì)胞膜結(jié)合提供了高效的構(gòu)象基礎(chǔ)。

3.2 N端與細(xì)胞膜的吸附結(jié)合

形成正確構(gòu)型的片球菌素，通過N端β折疊結(jié)構(gòu)域與目標(biāo)菌株的細(xì)胞膜相互結(jié)合。首先，該結(jié)構(gòu)域中帶正電荷氨基酸殘基通過非特異性的靜電引力與靶細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂基團(tuán)相互作用，使片球菌素的親水部分固定于細(xì)胞膜上[35]。因此，β折疊結(jié)構(gòu)域帶中正電荷氨基酸殘基的聚集區(qū)越多，片球菌素對(duì)靶細(xì)胞膜的親和力和結(jié)合力越強(qiáng)[36]；隨后，該結(jié)構(gòu)域與靶細(xì)胞膜上的甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(mannose phosphotransferase system, man-PTS)結(jié)合，錨定在細(xì)胞膜上[37]。

3.3 C端向膜內(nèi)插入

片球菌素錨定于細(xì)胞膜上后，其C端疏水性螺旋自然向細(xì)胞膜中間的疏水性區(qū)域插入，而C端區(qū)域插入的具體位置，由靶細(xì)胞膜上man-PTS的ⅡC和ⅡD亞基決定。首先，C端螺旋結(jié)構(gòu)在片球菌素插入靶細(xì)胞膜時(shí)可作為跨膜組分起作用，即疏水螺旋穿入靶細(xì)胞膜的疏水核心。隨后，特異性結(jié)合man-PTS的ⅡC和ⅡD亞基，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔[38]。在膜穿孔過程中，片球菌素與II C亞基特異性結(jié)合形成片球菌素-II C復(fù)合物，而II D亞基起到穩(wěn)定該復(fù)合物結(jié)構(gòu)的作用。KJOS等[39]在大腸桿菌中對(duì)單核增生李斯特菌的man-PTS的ⅡC和ⅡD亞基進(jìn)行異源表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，ⅡC亞基單獨(dú)表達(dá)時(shí)和ⅡC和ⅡD亞基共表達(dá)情況下，其對(duì)片球菌素敏感，且敏感性后者是前者的2倍，而當(dāng)對(duì)ⅡD亞基單獨(dú)表達(dá)時(shí)，大腸桿菌對(duì)片球菌素不敏感。因此，穩(wěn)定的片球菌素-IIC復(fù)合物的形成，對(duì)片球菌素抑菌功能的實(shí)現(xiàn)起到至關(guān)重要的作用。

3.4 在細(xì)胞膜上穿孔形成孔洞

片球菌素在靶細(xì)胞膜上形成孔洞后，直接導(dǎo)致胞內(nèi)鉀離子、氨基酸等小分子物質(zhì)外泄，使跨膜細(xì)胞質(zhì)子動(dòng)能勢(shì)(proton-motive force, PMF)喪失。MANDAL等[2]利用800 AU/mL的pediocin NV5對(duì)單核增生李斯特菌處理30 min后發(fā)現(xiàn)，溶液中鉀離子濃度提高7.5倍。然而，片球菌素作用于敏感細(xì)胞膜形成的孔洞直徑較小，ATP和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)會(huì)被截留在胞內(nèi)，PMF的喪失加速了胞內(nèi)ATP的消耗，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[40]。

4 片球菌素的構(gòu)效關(guān)系

Ⅱa類細(xì)菌素是以片球菌素的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)歸類的，其一級(jí)結(jié)構(gòu)通常包含37～48個(gè)氨基酸殘基，親水的陽離子N端區(qū)域含有1個(gè)保守的片球菌素框(pediocin box)區(qū)域，包含-YGNGV-基序[41-42]。二級(jí)結(jié)構(gòu)中N端區(qū)域通常形成β-折疊結(jié)構(gòu)域，C端結(jié)構(gòu)域由1～2個(gè)α螺旋組成兩親性或疏水性結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)中C端通常以一個(gè)結(jié)構(gòu)延伸的尾部折疊形成發(fā)夾狀，在β折疊的N末端區(qū)域和發(fā)夾狀C末端區(qū)域之間有1個(gè)柔性鉸鏈，可使2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間實(shí)現(xiàn)相對(duì)移動(dòng)[43]。大多數(shù)Ⅱa類細(xì)菌素N端均存在一對(duì)二硫鍵，對(duì)維持N端的兩親性結(jié)構(gòu)和β折疊結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定具有重要作用(圖2)。

圖2 pediocin PA-1(PDB ID: 5UKZ)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(使用SPDV4.10軟件生成) Fig.2 Tertiary structure of pediocin PA-1 (PDB ID: 5UKZ)

與Ⅱa類細(xì)菌素不同的是，片球菌素通常在其C端存在另一個(gè)二硫鍵，這使得片球菌素相對(duì)于其他Ⅱa類細(xì)菌素結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[38-44]。FIMLAND等[45]發(fā)現(xiàn)，同為Ⅱa類細(xì)菌素，C端含二硫鍵的pediocin PA-1與C端不含二硫鍵的sakacin P相比，雖然在20 ℃的條件下抑菌活性相同，但在37 ℃條件下，前者的抑菌活性為后者的10倍。

4.1 C端區(qū)域

C末端α螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)片球菌素發(fā)揮抑菌功能起著決定性作用，因此對(duì)該區(qū)域序列中的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行替代研究，可以有效提高片球菌素的抑菌功能。FIMLAND等[46]通過組合不同IIa類細(xì)菌素N端和C端區(qū)域，形成系列雜合細(xì)菌素。通過抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C末端相同的雜合肽其抑菌功能大體相同，而N末端相同的雜合肽抑菌活性差異巨大；C末端的抑菌活性與其氨基酸殘基組成直接相關(guān)。SUN等[47]通過對(duì)pediocin PA-1 C末端區(qū)域中8個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行突變，結(jié)果顯示，用疏水性氨基酸殘基Ala取代第29位的Gly后，抑菌活性有非常明顯的增加；HAUGEN等[48]利用帶負(fù)電荷的氨基酸殘基Asp替換pediocin PA-1 C末端一半螺旋區(qū)的片段中的所有殘基，結(jié)果表明，第20位的Lys被替代后，片球菌素抑制活性有明顯的降低。因此，疏水性和帶正電荷的氨基酸殘基，與C末端發(fā)揮抑菌作用直接相關(guān)。

4.2 N端區(qū)域

N端區(qū)域直接參與片球菌素與靶細(xì)胞膜結(jié)合。因此，對(duì)該區(qū)域序列中的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行替代研究，可使片球菌素與靶細(xì)胞更有效的結(jié)合，而更高的結(jié)合效率通常意味著發(fā)揮抑菌作用需要的濃度更低。SONG等[49]對(duì)pediocin PA-1 N端正電荷氨基酸殘基進(jìn)行插入和替代研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將其N端第0位插入1個(gè)帶正電荷的Lys，同時(shí)將第13位的Ser替換為L(zhǎng)ys后，片球菌素突變體對(duì)靶細(xì)胞的親和力升高，且對(duì)單核增生李斯特菌的抑菌濃度降低了50%，而在N端第10位的Gly替換為L(zhǎng)ys后，片球菌素變體對(duì)靶細(xì)胞的親和力降低，其抑菌濃度增加了10倍之多。因此，增加片球菌素N端特定位置帶正電荷氨基酸殘基，對(duì)其發(fā)揮抑菌功能具有提升作用。

4.3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和輔助蛋白

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是保證片球菌素向胞外分泌的關(guān)鍵。該蛋白由約700個(gè)氨基酸殘基組成，參與前導(dǎo)肽切割和成熟片球菌素向胞外分泌。因此，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對(duì)其發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)功能至關(guān)重要，二硫鍵通常具有維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用。OPPEG?RD等[50]用Ser替代pediocin PA-1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的Cys，結(jié)果顯示pediocin PA-1向胞外的分泌被完全抑制。這表明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定對(duì)其發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)片球菌素的功能至關(guān)重要。

片球菌素通常具有1～2對(duì)二硫鍵，輔助蛋白通常參與片球菌素二硫鍵的形成。輔助蛋白通常包含170個(gè)氨基酸殘基，其N端依靠2個(gè)Cys形成的1對(duì)二硫鍵維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。HAVARSTEIN等[51]分別用Ser替換pediocin PA-1輔助蛋白中的2個(gè)Cys，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，取代第86位Cys后形成正確二硫鍵pediocin PA-1的數(shù)量減少到之前的1/2，而取代第83位Cys后形成正確二硫鍵連接的pediocin PA-1幾乎完全消失。因此，輔助蛋白參與片球菌素二硫鍵的形成過程，同樣依賴于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

5 展望

近年來，生物防腐劑受到了越來越多的關(guān)注[52]。片球菌素作為一種高效、安全、無毒、無殘留的天然防腐劑，符合未來食品防腐領(lǐng)域的發(fā)展需求。片球菌素可強(qiáng)烈且專一抑制食物腐敗菌——李斯特菌，其較窄的抗菌譜可能意味著更強(qiáng)的靶向性且對(duì)人體微生態(tài)的平衡影響更小。目前，已知的片球菌素產(chǎn)生菌均為GRAS菌，即公認(rèn)的安全性菌種。片球菌素優(yōu)良的熱耐受性使其可被廣泛的用于需經(jīng)熱處理的食品，而其廣泛的pH耐受性，有效彌補(bǔ)了目前唯一商業(yè)化細(xì)菌素nisin僅存在于低pH值條件下的不足。片球菌素?zé)o毒、無色、無味，這些特點(diǎn)使其在食品領(lǐng)域發(fā)揮防腐作用的同時(shí)，不影響食物的風(fēng)味，而蛋白屬性又決定了其可被腸道內(nèi)的胰蛋白酶等降解，因此不必?fù)?dān)心殘留和環(huán)境釋放問題。未來，片球菌素作為食品添加劑大規(guī)模應(yīng)用于食品工業(yè)，還有待于以下方面研究的進(jìn)展：(1)高產(chǎn)片球菌素菌株的選育；(2)片球菌素專一性抑制李斯特菌機(jī)理的闡明；(3)利用分子手段，優(yōu)化片球菌素序列結(jié)構(gòu)，提高抗菌活性；(4)探索片球菌素在不同的食品加工環(huán)境和工藝下的應(yīng)用效果。同時(shí)，開展片球菌素與其他防腐手段，如高流體靜壓或脈沖電場(chǎng)等協(xié)同作用的抑菌效果研究，也將拓寬其應(yīng)用范圍。相信隨著相關(guān)研究的不斷深入，片球菌素在食品領(lǐng)域，防止李斯特菌侵染方面將發(fā)揮重要的作用。