Biacore 分子互作技術(shù)加速抗體藥研發(fā)和申報(bào)

文/張睿

抗體藥研發(fā)涉及篩選、活性檢測(cè)、表位作圖、一致性評(píng)價(jià)、免疫原性和質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)——Biacore 作為藥物活性檢測(cè)平臺(tái)，可以滿足藥物研發(fā)多個(gè)環(huán)節(jié)的需求，加快研發(fā)速度，其準(zhǔn)確穩(wěn)定的數(shù)據(jù)質(zhì)量已經(jīng)得到了藥企和監(jiān)管部門(mén)的廣泛應(yīng)用和認(rèn)可。本文將利用抗體研發(fā)與質(zhì)控中的幾個(gè)重要環(huán)節(jié)來(lái)展示Biacore 分子互作技術(shù)的原理和應(yīng)用。

抗體藥具有性能均一、特異性好的優(yōu)勢(shì)，在腫瘤、免疫等各類(lèi)疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）頒布了多個(gè)抗體藥物法規(guī)及指導(dǎo)原則，規(guī)范抗體藥物的研發(fā)生產(chǎn)及申報(bào)流程。隨著原研藥在國(guó)內(nèi)的上市和藥品采購(gòu)價(jià)格的下滑，加快研發(fā)效率、降低生產(chǎn)成本成為抗體藥市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)鍵。抗體藥研發(fā)涉及篩選、活性檢測(cè)、表位作圖、一致性評(píng)價(jià)、免疫原性和質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)。Biacore 作為藥物活性檢測(cè)平臺(tái)，可以滿足藥物研發(fā)多個(gè)環(huán)節(jié)的需求，加快研發(fā)速度，其準(zhǔn)確穩(wěn)定的數(shù)據(jù)質(zhì)量已經(jīng)得到了藥企和監(jiān)管部門(mén)的廣泛應(yīng)用和認(rèn)可。目前，Biacore 基于表面等離子共振技術(shù)已經(jīng)被中國(guó)、美國(guó)和日本藥典收錄。本文將利用抗體研發(fā)與質(zhì)控中的幾個(gè)重要環(huán)節(jié)來(lái)展示Biacore分子互作技術(shù)的原理和應(yīng)用。

圖1 Biacore 技術(shù)檢測(cè)Taltz 與IL-17A 的親和力結(jié)果

抗體篩選與定量

細(xì)胞株的好壞很大程度上決定了抗體藥的質(zhì)量和成本，因此細(xì)胞株的篩選與定量是抗體藥研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。ELISA 法由于檢測(cè)精度差、自動(dòng)化程度低等問(wèn)題，已經(jīng)無(wú)法滿足細(xì)胞株篩選的要求。Biacore 技術(shù)可以大大提高抗體篩選的效率和準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)上清、腹水的直接檢測(cè)。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)在抗體篩選中尤為關(guān)鍵，因?yàn)榻怆x速率決定了抗體的在靶時(shí)間，解離速率慢的抗體成藥性更好。Biacore 技術(shù)通過(guò)檢測(cè)解離速率的快慢完成排序，抓取出想要的候選分子。表達(dá)量也是細(xì)胞株開(kāi)發(fā)的重要指標(biāo)，在采用Biacore技術(shù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)篩選時(shí)，同時(shí)還可以基于捕獲量的高低對(duì)抗體濃度進(jìn)行定量，將濃度定量與篩選實(shí)驗(yàn)合二為一，大大簡(jiǎn)化了篩選流程。例如，羅氏（Roche）就采用了Biacore 技術(shù)進(jìn)行抗體篩選，在24 h 內(nèi)完成了近400 個(gè)抗體的檢測(cè)，并篩選出了慢解離的候選抗體，進(jìn)行進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

藥物結(jié)合活性綜合表征

在抗體體外生物活性檢測(cè)項(xiàng)目中，抗體與抗原、Fcγ 受體、FcRn 以及C1q 的親和檢測(cè)均需采用Biacore 技術(shù)進(jìn)行申報(bào)。目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市的70 多種抗體藥物中有近80%采用了Biacore 技術(shù)完成研發(fā)和申報(bào)。例如，禮來(lái)的Taltz在2016 年獲得FDA 批準(zhǔn)用于治療銀屑病。Taltz 對(duì)IL-17A 具有較高的親和力和特異性，可以抑制IL-17A 與IL-17 受體的結(jié)合。在申報(bào)材料中，Biacore 技術(shù)用于檢測(cè)Taltz 與靶點(diǎn)IL-17A 的親和力（圖1）。

治療性抗體的功效不僅取決于Fab 片段結(jié)合抗原的活性，還取決于其Fc 片段與Fcγ 受體的相互作用，F(xiàn)cγ 受體的親和力能夠作為藥物功效及半衰期的預(yù)測(cè) 指 標(biāo)。2013 年，Roche 針 對(duì)CD20 靶點(diǎn)的單抗Gazyva 獲批上市，用于慢性淋巴性白血病的治療。在申報(bào)材料中，Biacore 技術(shù)用于Fcγ 受體結(jié)合活性的測(cè)定，結(jié)果顯示Gazyva 比美羅華有更好的FcγRIII 結(jié)合能力（圖2）。

抗體與FcRn 的親和強(qiáng)弱程度可以預(yù)測(cè)抗體的半衰期。Celltrion 公 司 的Inflectra 是Remicade 的生物仿制藥。在申報(bào)材料中，Biacore 技術(shù)用于證明Inflectra 和Remicade 與FcRn 結(jié)合的一致性（圖3）。

C1q 是補(bǔ)體激活途徑中的啟動(dòng)蛋白，C1q 的常規(guī)檢測(cè)方法為ELISA，但由于抗體和C1q 的結(jié)合較弱，采用ELISA 法檢測(cè)可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此很多企業(yè)選擇采用Biacore 技術(shù)檢測(cè)抗體和C1q 的結(jié)合，如羅氏的抗體藥Ocrevus。

圖2 Biacore 技術(shù)檢測(cè)Gazyva 和Rituximab 與Fcγ 受體的親和力數(shù)據(jù)

一致性評(píng)價(jià)

2016 年起，國(guó)務(wù)院和國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）發(fā)布了多個(gè)一致性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)文件，對(duì)通過(guò)一致性評(píng)價(jià)的品種給予優(yōu)先支持、醫(yī)保支付等優(yōu)待。一致性評(píng)價(jià)中關(guān)鍵一環(huán)是說(shuō)明藥物的生物活性和原研藥的相似性。在FDA 生物類(lèi)似藥指南中，Biacore 技術(shù)是結(jié)合測(cè)定的首推方法。眾多企業(yè)在一致性評(píng)價(jià)中紛紛采用Biacore 技術(shù)進(jìn)行了申報(bào)上市，如Zarxio、Inflectra 以及Benepali 等。Biacore 獨(dú)創(chuàng)性地開(kāi)發(fā)了指紋圖譜比對(duì)功能，利用其可以直接進(jìn)行傳感圖細(xì)節(jié)比對(duì)并作出相似性打分，避免了由于擬合模型選擇等操作帶來(lái)的分析誤差，使結(jié)果更加直觀和準(zhǔn)確（圖4）。

圖3 Biacore 技術(shù)檢測(cè)Inflectra 和Remicade 與FcRn的親和結(jié)果圖

Sandoz 公 司 的GP2013 是 美羅華的生物類(lèi)似藥。在GP2013 的申報(bào)材料中，Biacore 技術(shù)被用于Fcγ 受體的親和力測(cè)定，用來(lái)說(shuō)明GP2013 與原研藥的高度相似性（圖5）。

圖4 Biacore 平臺(tái)獨(dú)創(chuàng)性指紋圖譜比對(duì)技術(shù)

生物活性質(zhì)量控制

抗體藥物由于分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物活性敏感，其工藝中每個(gè)環(huán)節(jié)的變化都可能導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量出現(xiàn)差異。因此企業(yè)應(yīng)對(duì)抗體藥物工藝流程中的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（特別是生物活性）進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、控制和放行。基于Biacore 平臺(tái)可以建立全面的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，完成結(jié)合活性、活性濃度、翻譯后修飾和雜質(zhì)含量等的質(zhì)量控制。Biacore 平臺(tái)可以實(shí)時(shí)監(jiān)控各工藝流程組分中抗體的生物活性，如細(xì)胞培養(yǎng)、過(guò)濾、澄清等；活性有問(wèn)題的抗體會(huì)出現(xiàn)解離加快、結(jié)合信號(hào)降低的現(xiàn)象，以幫助企業(yè)快速發(fā)現(xiàn)工藝中的問(wèn)題。

Biacore 技術(shù)還可以用于最終產(chǎn)品的批次放行，例如金賽藥業(yè)基于Biacore 技術(shù)的生長(zhǎng)激素蛋白批次放行標(biāo)準(zhǔn)獲得了中國(guó)食品藥品檢定研究院審批通過(guò)（圖6）。

蛋白總濃度并不能反映藥物的有效濃度，活性濃度才是影響藥效的關(guān)鍵指標(biāo)。Biacore 活性濃度定量方法精度高、線性好，得到了眾多用戶的青睞。例如，諾華的奧馬珠單抗采用了Biacore 技術(shù)作為其工藝濃度控制的手段（圖7）。

翻譯后修飾對(duì)于維持抗體的正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，是質(zhì)量控制中的關(guān)鍵一環(huán)。利用Biacore 技術(shù)可以比較不同翻譯后修飾前后對(duì)抗體生物活性和穩(wěn)定性的影響，如糖基化、脫酰胺化等。

圖5 Biacore 技術(shù)檢測(cè)GP2013 和美羅華與Fcγ 受體的結(jié)合相似性

圖6 Biacore 技術(shù)在藥物批次放行中的應(yīng)用

圖7 利用Biacore 技術(shù)測(cè)定奧馬珠單抗的活性濃度

小結(jié)

Biacore 分子互作技術(shù)除了在以上抗體篩選、生物活性、一致性評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制中的應(yīng)用外，在表位分析、抗體改造、免疫原性等環(huán)節(jié)也發(fā)揮著巨大作用。Biacore 技術(shù)符合GxP 和21 CFR Part 11 法規(guī)的要求，其準(zhǔn)確穩(wěn)定的數(shù)據(jù)質(zhì)量已經(jīng)得到了藥企和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛應(yīng)用和認(rèn)可，能夠?yàn)榧涌炜贵w藥物上市保駕護(hù)航。