NRG1促進Wharton’sjelly間充質干細胞表達VEGF

趙永成，于 薇，任可馨，付 微，梁 軍

（牡丹江醫學院干細胞研究所，黑龍江 牡丹江 157011）

臍帶Wharton’s jelly間充質干細胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells，WJMSCs）被認為是理想的干細胞源[1]。但移植的細胞存在存活率低的問題。神經調節蛋白1（neuregulin-1，NRG-1）屬于生長和分化因子家族，可參與血管新生[2]。在體外，BMP4可否通過上調WJMSCs表達血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），進而促進血管新生改善細胞生存環境，未查見相關報道。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍帶（牡丹江紅旗醫院）；FBS、DMEM培養基（Hyclone）；NRG-1質粒（牡丹江醫學院干細胞研究所）；ELISA試劑盒（Takara）；VEGF抗體（Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 細胞提取

取剖腹產臍帶，剪成直徑約0.3 cm的組織塊，用10%FBS-DMEM培養液培養組織塊；每2 d換液一次；細胞融合至90%時傳代。

1.2.2 實驗分組

實驗分為轉染組和未轉染組。

1.2.3 細胞轉染

取第三代細胞，按Lipofectamine TM 2000說明書把VEGF質粒轉染細胞。細胞轉染3天后，進行VEGF檢測。

1.2.4 ELISA檢測

按ELISA試劑盒說明書檢測上清液中VEGF的含量。用酶標儀在450 nm波長下檢測樣本OD值。

1.2.5 免疫熒光檢測

4%多聚甲醛固定15 min后1%牛血清白蛋白封閉25 min；VEGF抗體孵育100 min；二抗孵育50 min；DAPI復染15 min。陽性率=紅色熒光數／藍色熒光數×100%。

1.3 統計學方法

統計分析采用SPSS 13.0軟件，計量數據以±s表示，組間比較采用單因素方差，差異顯著的判斷標準為P＜0.05。

2 結 果

2.1 ELISA檢測結果

如表1所示，轉染組上清液VEGF的含量與對照組的比較，具有統計學意義。

表1 ELISA檢測細胞培養上清液中VEGF的含量（ng/mL，n＝6）

2.2 免疫熒光檢測結果

陽性細胞的胞質和突起呈紅色熒光；經非特異性染色的細胞核呈藍色熒光（圖1）。轉染組的陽性細胞表達率與對照組的比較，具有統計學意義（表2）。

圖1 免疫熒光紅色染色VEGF陽性細胞

表2 VEGF陽性細胞表達率（±s，n=6，%）

表2 VEGF陽性細胞表達率（±s，n=6，%）

注：★與未轉染組比較， P＜0.05。

組別 VEGF未轉染組 24.86±3.27轉染組 93.47±4.23★

3 討 論

NRG1可促進多種細胞表達VEGF。NRG1可使發育的心肌增強VEGF的表達[3]；還能增加VEGF在人冠狀動脈平滑肌細胞中的表達[4]。在病理情況下，結腸癌患者的活檢標本中，NRG1與VEGF表達呈正相關[5]。本研究發現，NRG1可促進WJMSCs表達VEGF。這些研究結果表明，NRG1可調控VEGF的表達，進而參與增生、抗凋亡和血管新生等多種生物學過程。

NRG1的配體是酪氨酸激酶（Erythroblastic leukemia viral oncogene homologs，ErbB）受體。NRG1∕ErbB信號不僅通過促VEGF表達途徑[5]，還可通過直接作用血管內皮[2]和血管平滑肌[6]途徑促進血管新生。