人參多糖對(duì)乙醇依賴小鼠戒斷行為及血漿ACTH和皮質(zhì)醇的影響

盧 夢(mèng)，王 鑫，宋 伍，周東月，王慧玲，魏 琳，卞 男，李雪婷，郭 焱

0 引言

乙醇依賴是一個(gè)全球性問(wèn)題。長(zhǎng)期攝入乙醇停藥后會(huì)引起嚴(yán)重的包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度興奮、震顫、焦慮、失眠和癲癇發(fā)作等戒斷癥狀[1-3]。研究顯示，乙醇中毒和戒斷能激活下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸，提高嚙齒動(dòng)物皮質(zhì)酮循環(huán)和增加皮質(zhì)醇水平，表現(xiàn)為飲酒量的增加[4]。臨床研究顯示，即使經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的戒斷，乙醇依賴患者仍然有更高的復(fù)發(fā)飲大量酒的風(fēng)險(xiǎn)，乙醇依賴戒斷患者接受乙醇相關(guān)刺激會(huì)釋放皮質(zhì)醇[5-6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在急性乙醇戒斷時(shí)，血漿皮質(zhì)醇水平顯著升高，而ACTH水平降低[7]。

人參多糖(Ginseng polysaccharides，GSP)作為人參(Panax ginseng C.A.Mey.)的主要化學(xué)成分之一，具有廣泛的生物學(xué)活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖和神經(jīng)保護(hù)等作用[8-13]。近年研究顯示，人參多糖具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的作用，可顯著提高大鼠血漿ACTH含量[14-15]。目前，尚無(wú)人參多糖對(duì)乙醇成癮作用的報(bào)道。因此，本研究建立了乙醇依賴模型，觀察人參多糖對(duì)乙醇依賴戒斷小鼠血漿ACTH和皮質(zhì)醇及焦慮相關(guān)行為的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡KM雄性小鼠(22±2) g，購(gòu)于吉林省長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，實(shí)驗(yàn)期間自由獲取食物和水，飼養(yǎng)室溫濕度分別控制在(23±2)℃和50%±5%范圍內(nèi)，12 h/12 h明暗交替。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)2011-0004。

1.2 試劑與儀器 無(wú)水乙醇(北京化工廠，批號(hào)：20180518)，促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，皮質(zhì)醇(Cortisol)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，明暗箱(上海欣軟信息科技有限公司)，PMT-100高架十字迷宮(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 藥物 人參多糖粉末由吉林省中醫(yī)中藥研究所提供，制備方法沿用實(shí)驗(yàn)室前期的方法。人參粉碎，采用水提醇沉法和Sevag除蛋白法得到人參多糖粗提物，粗提物用0.002 mol/L NaCl溶解，至已用0.002 mol/L NaCl平衡的DEAE-T0Y0PAERL柱上，用上述溶劑洗脫。再用0.002～0.25 mol/L NaCl梯度洗脫，得分子量為5.5×103～2.5×104的多糖部分。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及給藥 將小鼠隨機(jī)分為5組：空白組、模型組和GSP 3個(gè)劑量組(100、200、400 mg/kg)，每組20只。模型組及GSP 3個(gè)劑量組分別灌胃給予生理鹽水和人參多糖溶液，30 min后，除空白組外，其余各組腹腔注射2.5 g/kg乙醇溶液(20%，v/v，生理鹽水配制)，1次/d，連續(xù)給藥15 d。每組10只，用于行為學(xué)檢測(cè)，另外10只在乙醇末次給藥后24 h后處死，取血，用于ACTH和皮質(zhì)醇含量的檢測(cè)。

2.2 明暗箱實(shí)驗(yàn) 連續(xù)給予乙醇15 d后，停藥24 h進(jìn)行明暗箱實(shí)驗(yàn)。明暗箱由暗室(27 cm×17 cm×27 cm)和明室(27 cm×27 cm×27 cm)(明室內(nèi)裝有550～650勒克斯的照明燈)組成，兩室由一個(gè)中央開(kāi)口(6 cm×6 cm)的擋板隔開(kāi)，小鼠可以通過(guò)它在兩室之間自由穿梭。將小鼠置于明室中央，記錄10 min內(nèi)在兩室間穿行次數(shù)及在明室滯留時(shí)間。每次實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用75%的乙醇擦拭，以去除前一只小鼠的氣味。

2.3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 高架十字迷宮由高出地面50 cm的2個(gè)相對(duì)的開(kāi)放臂(30 cm×6 cm×0.6 cm)，2個(gè)相對(duì)的閉合臂(30 cm×6 cm×15 cm)及連接四臂的中央平臺(tái)(6 cm×6 cm)組成。在明暗箱實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠被置于高架十字迷宮中央進(jìn)行5 min的自由探索，之后記錄5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入開(kāi)臂和閉臂的次數(shù)及其停留時(shí)間。每次實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用75%的乙醇擦拭高架十字迷宮。

開(kāi)臂次數(shù)比=開(kāi)臂次數(shù)/(開(kāi)臂次數(shù)+閉臂次數(shù))×100%

開(kāi)臂時(shí)間比=開(kāi)臂時(shí)間/(開(kāi)臂時(shí)間+閉臂時(shí)間)×100%

2.4 乙醇戒斷癥狀評(píng)分 末次給予乙醇后24 h、48 h、72 h觀察5 min內(nèi)小鼠的戒斷癥狀，觀察每只小鼠以下的行為體征：刻板行為、激惹行為、尾巴強(qiáng)直和異常姿勢(shì)。刻板行為包括理毛、嗅、搖頭、咬和咀嚼5種，依據(jù)表現(xiàn)出刻板行為的種類計(jì)為1、2、3、4、5分。激惹行為計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：輕微或中等激惹記為1分，極易激惹記為2分，接觸時(shí)叫或中等攻擊性記為3分，接觸時(shí)叫或極具攻擊性記為4分，自發(fā)性叫或極具攻擊性記為5分。尾巴強(qiáng)直計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：輕度尾巴強(qiáng)直記為1分，中度尾巴強(qiáng)直記為2分，尾巴強(qiáng)直但行走時(shí)有輕度彈性記為3分，尾巴強(qiáng)直且行走時(shí)無(wú)彈性記為4分，尾巴極度強(qiáng)直且行走時(shí)無(wú)彈性記為5分。異常姿勢(shì)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：輕微低頭拱背記為1分，中度低頭記為2分，顯著低頭拱背記為3分，低頭拱背加后肢分開(kāi)記為4分，低頭拱背加前肢分開(kāi)記為5分。

2.5 乙醇戒斷小鼠血漿ACTH、皮質(zhì)醇水平的變化 每組取10只小鼠，摘眼球取血，-20 ℃保存。檢測(cè)方法為競(jìng)爭(zhēng)法，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 人參多糖對(duì)小鼠乙醇戒斷后焦慮行為的影響

3.1.1 明暗箱實(shí)驗(yàn) 與空白組小鼠比較，模型組小鼠在明暗室中穿梭次數(shù)減少，在明室停留時(shí)間縮短(P<0.05)；與模型組小鼠比較，預(yù)先給予中、高劑量的GSP可以明顯增加乙醇戒斷小鼠在明暗室中穿梭次數(shù)，延長(zhǎng)在明室停留時(shí)間(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠明暗室穿梭次數(shù)和在明室停留時(shí)間比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.1.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 與空白組比較，模型組進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)比降低(P<0.05)，在開(kāi)臂停留時(shí)間縮短(P<0.05)，提示小鼠慢性乙醇戒斷出現(xiàn)焦慮樣行為。與模型組小鼠比較，GSP中、高劑量組小鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)比和在開(kāi)臂停留時(shí)間比明顯提高(P<0.05)，提示中、高劑量GSP對(duì)小鼠慢性乙醇戒斷引起的焦慮樣行為有改善作用。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)比、開(kāi)臂停留時(shí)間比情況(%)

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.1.3 乙醇戒斷癥狀評(píng)分 乙醇戒斷后24～72 h，模型組小鼠戒斷評(píng)分均顯著高于空白組小鼠(P<0.05)。與模型組比較，GSP中、高劑量小鼠戒斷評(píng)分均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠不同時(shí)間戒斷評(píng)分

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 人參多糖對(duì)乙醇戒斷小鼠血漿ACTH、皮質(zhì)醇水平的影響 血漿ACTH、皮質(zhì)醇水平測(cè)試結(jié)果顯示，模型組血漿ACTH水平低于空白組(P<0.05)，皮質(zhì)醇高于空白組(P<0.05)。GSP中、高劑量組血漿ACTH水平高于模型組(P<0.05)，皮質(zhì)醇水平低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠血漿ACTH和皮質(zhì)醇水平

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

目前，對(duì)乙醇成癮機(jī)制的認(rèn)識(shí)多集中在乙醇對(duì)多巴胺能神經(jīng)通路的直接或間接作用。近年研究表明，乙醇直接刺激HPA軸對(duì)下丘腦、邊緣系統(tǒng)和內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體產(chǎn)生影響，后者進(jìn)一步促進(jìn)乙醇成癮的進(jìn)程[5]。Edwards等[7]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期攝入乙醇的戒斷過(guò)程影響應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)通路，導(dǎo)致HPA軸的功能受損。慢性乙醇成癮及復(fù)飲時(shí)皮質(zhì)醇含量顯著增加，并可與大腦的獎(jiǎng)賞系統(tǒng)相互作用，從而增加乙醇的攝入量[16]。Rabat等[17]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇戒斷小鼠乙醇攝取量顯著增加并伴隨著血漿皮質(zhì)酮濃度的升高。

已有研究證實(shí)了人參的活性成分在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的保護(hù)作用，如有助于預(yù)防抑郁癥，間接地增強(qiáng)記憶以及改善焦慮等[14]。盡管此類研究集中在人參皂苷上，但近年來(lái)對(duì)人參多糖神經(jīng)保護(hù)作用的研究越來(lái)越多，有報(bào)道，人參酸性多糖能改善小鼠抑郁行為[15]。人參多糖的神經(jīng)保護(hù)作用提示其可能具有抗乙醇成癮的作用。本研究建立了乙醇戒斷模型用于評(píng)估人參多糖的抗戒斷作用。明暗箱實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠在明暗室中穿梭次數(shù)減少，在明室停留時(shí)間縮短，進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)比和在開(kāi)臂停留時(shí)間比降低，與前期研究結(jié)果一致[18]。GSP連續(xù)給藥可緩解由乙醇戒斷引起的焦慮相關(guān)行為變化及戒斷評(píng)分，停藥后24 h小鼠的戒斷體征最顯著，這一結(jié)果與Zhu等[19]研究一致。因此，本研究考察了停藥 24 h的ACTH和皮質(zhì)醇的含量。另外，與納曲酮治療乙醇急性戒斷的結(jié)果相似，GSP對(duì)乙醇急性戒斷期血漿ACTH水平降低和皮質(zhì)醇水平升高也有抑制作用[20]。

綜上，人參多糖可能通過(guò)作用HPA軸的相關(guān)受體改善乙醇戒斷引起的行為學(xué)改變。本研究為今后進(jìn)一步研究人參多糖對(duì)乙醇成癮的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為乙醇戒斷綜合征提供新的治療藥物。