丁苯酞軟膠囊對頸動脈狹窄大鼠大腦缺血再灌注后Smac蛋白的影響

黃 優，陳海云，何超明，龐明武，顏 博，王 景，李華堅，高唯一

0 引言

腦梗死是最常見的缺血性腦血管疾病，頸動脈狹窄是缺血性腦血管病的重要危險因素，流行病學統計顯示，頸動脈狹窄是進行性腦梗死的重要危險因素[1]，其同側腦梗死的發病率可以達到90%以上。丁苯酞(Butyphthalide)是從芹菜籽中提取的天然產物，可以發揮神經保護功能[2]，次級線粒體源性Caspase激活因子(Smac，又稱低等電點的IAP直接結合蛋白)是決定腦缺血后腦細胞凋亡的關鍵蛋白[3]。本研究構建頸動脈狹窄大鼠模型，在此基礎上探討丁苯酞對模型大鼠腦組織缺血再灌注后Smac蛋白的影響以及神經保護作用，為丁苯酞的臨床應用提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器 SPF級健康雄性SD 大鼠，8周齡，體重260～310 g，購自海南醫學院動物實驗中心，動物許可證號：SCXK(瓊)2018-0004。丁苯酞膠囊購自石藥集團恩必普藥業有限公司(批號：20180216)，Smac和β-actin多克隆抗體購自美國Santa公司，HRP標記二抗購自北京中杉生物科技股份有限公司，Bradford蛋白定量試劑盒和TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自北京碧云天生物技術有限公司，顯微鏡和HPIAS-1000圖像分析系統為德國Leica公司產品，電泳儀為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 大鼠動物模型的建立 SD大鼠適應性喂養1周后建模，隨機分為假手術組(15只)和頸動脈狹窄模型組(60只)，參照鄭文婧等[4]的方法，造模簡述如下：10%水合氯醛1 ml腹腔注射，大鼠麻醉后沿頸部正中切開，分離右頸總動脈后平行放置5 ml注射器針頭，6-0號尼龍線扎緊針頭和頸總動脈，抽出針頭，見血流恢復后間斷縫合肌肉和皮膚，假手術組只分離右頸總動脈，不做尼龍線結扎，術后注射青霉素鈉防止感染。喂養6周后，血管超聲顯示，手術側右頸總動脈峰值血流速度155～170 cm/s、舒張末血流速度60～100 cm/s為頸動脈狹窄造模成功。隨后參照Han等[5]的方法，使用頸動脈狹窄模型大鼠構建大腦中動脈缺血(MCAO)模型。頸動脈狹窄模型大鼠隨機分為對照組、低劑量丁苯酞(20 mg/kg)組、中劑量丁苯酞(40 mg/kg)組和高劑量丁苯酞(80 mg/kg)組，每組15只。丁苯酞組在建模前3 d，每天給予20、40、80 mg/kg丁苯酞灌胃，對照組和丁苯酞組水合氯醛麻醉后，分離狹窄側右頸總動脈，插入尖端涂有硅橡膠的尼龍單絲縫合線，進入約2 cm達大腦中動脈處，阻塞1.5 h后取出縫線恢復血供，縫合皮膚，術后注射青霉素鈉防止感染。假手術組僅分離血管，不插入尼龍線。

1.3 神經功能評分[5]MCAO造模后24 h使用平衡木實驗(Beam balance test，BBT)進行神經功能評分，把小鼠置于1.5 cm的平板上，站穩無搖晃持續2 min記1分，站穩有搖晃但可以持續2 min記2分，滑至一側但2 min內未掉下記3分，2 min內掉下記4分，數秒內掉下記5分，無法站立記6分。

1.4 HE、TUNEL染色 各組SD大鼠造模24 h后，麻醉斷頭取缺血腦組織固定于4%甲醛，24 h后包埋于石蠟中，切成5 μm冠狀切片。常規HE染色顯微鏡下觀察神經元細胞變化，TUNEL染色嚴格按照試劑盒說明書操作，TUNEL染色陽性細胞為神經元胞體萎縮，深褐染細胞，是凋亡細胞。顯微鏡下隨機選擇5個缺血半暗帶區的高倍視野(200×)，計算每個樣品的凋亡指數(Apoptotic index，AI)=陽性凋亡細胞數/總細胞數。

1.5 Smac蛋白的Western blot檢測 各組SD大鼠造模24 h后，麻醉斷頭取缺血腦組織100 mg加入蛋白裂解液，提取細胞總蛋白，Bradford法蛋白定量后，取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉印蛋白至PVDF膜，然后加入Smac (1∶1 000)或β-actin一抗(1∶5 000)，4 ℃過夜后加入二抗(1∶5 000) 2 h，化學發光法掃描條帶，用Bandscan5.0軟件計算Smac的相對灰度值。

1.6 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件。對于符合正態分布的計量資料，多組均數間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丁苯酞對模型SD大鼠神經功能的影響 假手術組、對照組、低劑量丁苯酞組、中劑量丁苯酞組和高劑量丁苯酞組SD大鼠BBT評分分別為1.07±0.12、5.64±1.06、4.84±0.82、4.13±0.65、3.76±0.52，各組間差異有統計學意義(F=8.71，P<0.05)。

2.2 丁苯酞對模型SD大鼠缺血區神經元細胞形態以及凋亡的影響 HE染色顯示，正常神經元細胞染色清晰，胞漿豐富，核居中，核仁清晰，排列整齊，見圖1細黑箭頭所指；缺血再灌注模型組見神經元丟失，退行性變，神經元細胞收縮、核固縮、細胞間隙增大，見圖1粗黑箭頭所指。給予丁苯酞干預后，這種損傷神經元顯著減少。經TUNEL染色后顯示，假手術組、對照組、低劑量丁苯酞組、中劑量丁苯酞組和高劑量丁苯酞組SD凋亡指數分別為0.00±0.00、0.75±0.18、0.62±0.14、0.47±0.10、0.32±0.07，各組間差異有統計學意義(F=9.684，P<0.05)。凋亡細胞見圖2中黑箭頭所指。

2.3 丁苯酞對模型SD大鼠缺血區Smac蛋白表達的影響 從圖3可見，缺血再灌注模型大鼠Smac蛋白表達升高，給予丁苯酞干預后，缺血再灌注導致的Smac蛋白升高得到了抑制。經灰度掃描，假手術組、對照組、低劑量丁苯酞組、中劑量丁苯酞組和高劑量丁苯酞組Smac蛋白的相對灰度值分別為0.076±0.012、0.852±0.143、0.705±0.127、0.382±0.073、0.115±0.024，各組間差異有統計學意義(F=12.71，P<0.05)。

圖1 缺血區腦組織的HE染色(200×)

圖2 缺血區腦組織的TUNEL染色(200×)

圖3 Smac蛋白表達的Western blot檢測

注：A.假手術組,B.對照組,C.低劑量丁苯酞組,D.中劑量丁苯酞組,E.高劑量丁苯酞組.

3 討論

流行病學調查顯示，60%左右的腦梗死患者存在頸動脈狹窄，快速恢復血供是腦梗死患者臨床治療的關鍵[6]，但恢復血供再灌注后，有時腦組織的損傷更加嚴重，缺血再灌注損傷成為影響腦梗死患者臨床療效的重要因素[7]。丁苯酞是我國自主研發的藥物，動物實驗和臨床治療研究均顯示了其可以發揮神經保護功能[8-9]，而且對顱內動脈狹窄患者也可以發揮治療作用[10]。本研究結果顯示，模型組神經功能受損，鏡下神經元退行性變，說明造模成功，提前給予丁苯酞干預后神經功能評分顯著減低，呈劑量依賴性，鏡下退行性變的神經元減少。袁齊宏等[11]采用大鼠腦中動脈栓塞模型，發現丁苯酞可以對腦缺血再灌注大鼠神經功能起到保護作用，但未對其機制進行深入探討。

凋亡通路是神經元細胞死亡的一條主要通路，Smac蛋白含有184個氨基酸，是凋亡通路中的重要蛋白，Smac蛋白表達升高后可以競爭性結合XIAP、Apaf-1凋亡復合體，解除凋亡復合體對Caspase-9和Caspase-3的抑制，促進細胞凋亡的發生[12]。在缺血再灌注腦組織中已經發現了致凋亡蛋白Smac的表達顯著增高。李國前等[13]研究顯示，抑制Smac信號通路可以顯著減少腦缺血再灌注模型大鼠的神經細胞凋亡，發揮神經保護作用。本研究結果顯示，缺血再灌注模型組大鼠腦組織Smac蛋白顯著升高，丁苯酞可以劑量依賴性地緩解缺血再灌注模型組大鼠腦組織Smac蛋白的升高。本研究也發現了缺血再灌注模型組大鼠腦組織神經元細胞凋亡顯著增加，而丁苯酞可以劑量依賴性地減低缺血再灌注模型組大鼠神經元的凋亡，提示丁苯酞下調Smac蛋白表達，可能是其發揮神經保護作用的主要機制。

綜上所述，本研究顯示，丁苯酞可以顯著減低Smac蛋白表達，抑制頸動脈狹窄大鼠缺血再灌注損傷誘發的神經元凋亡，發揮神經功能保護作用。