小劑量紅霉素對香煙煙霧誘導肺氣腫中缺氧誘導因子-1α的抑制作用及其機制

顧冬雪，谷 秀，張雪云

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以慢性氣道炎癥為本質的慢性氣道疾病，表現為不完全可逆的氣流受限，嚴重者伴有呼吸衰竭，乃至死亡。近年來COPD的發病率不斷增加，其發病機制十分復雜，確切病因不清楚，因目前還沒有特效藥物能遏制其病情的進行性發展，亟待尋找有效的可逆轉病情的治療藥物。大環內酯類抗生素是臨床中較為常用的抗感染藥物，但目前諸多研究闡明了該類藥物的抗感染之外的抗炎作用，尤其是作用于慢性氣道性疾病，如彌漫性泛細支氣管炎等[1]；目前亦有研究顯示了其在COPD中的抗炎作用[2]，筆者前期的研究顯示，小劑量紅霉素可通過MAPK途徑抑制煙霧誘導的大鼠肺氣腫的形成[3]。但目前對于紅霉素作用于肺氣腫形成及發展的機制尚未完全明確。低氧誘導因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是機體在低氧等條件下產生的轉錄因子，維持著體內氧穩態，可調控與血管生成、糖代謝、細胞增殖等相關的多種基因表達[4]。近年來，國外對HIF-1α的研究顯示，其與炎癥反應有密切的聯系[5]，諸多研究顯示，HIF-1α可能參與了炎癥性疾病的發生發展。本文通過香煙煙霧誘導大鼠慢性氣道炎癥模型，給予紅霉素干預后，觀察HIF-1α的改變及其機制。

1 研究方法

1.1 動物模型的制備 所有實驗均按照中國醫科大學動物研究倫理委員會的指導進行。從中國醫科大學實驗動物中心獲得雄性Wistar大鼠[9～10周齡，(200±18)g]，在SPF飼養環境中飼養。實驗動物于實驗前1周開始飼養。大鼠分籠(每籠10只)飼養，室溫維持在23～26 ℃左右，飼養期間大鼠自由攝食及飲水，室內光線12 h規則變化。大鼠隨機分為3組,每組8只：正常對照組(C組),香煙煙霧模型組(CS組),紅霉素+香煙煙霧模型(ERY+CS組)。CS組大鼠暴露于16支香煙(萬寶路;美國紐約州;每支香煙中含有0.9 mg尼古丁，14 mg一氧化碳和12 mg焦油)煙霧中;煙霧鏡v/V%為8%)，每天2次，每周6 d，共12周，每次30 min，然后將濾網移除。ERY+CS組大鼠暴露于CS 12周，每天口服1次ERY(Sigma-Aldrich；Merck，德國)灌胃，劑量為100 mg/kg。從12周暴露期的第1天開始，在香煙煙霧暴露前0.5 h進行藥物治療。對照組每天鹽水作為對照灌胃。每天觀察各組大鼠被毛、活動性、飲食、咳嗽等一般情況。在第12周結束時，在麻醉下[40 mg/kg戊巴比妥(Sigma-Aldrich；Merck，德國)]腹腔注射后放血處死大鼠，分離肺組織。取右葉保存于-80 ℃。大鼠肺的左葉(未灌洗)在含5 mM CaCl2+1 mM MgCl2的冰冷鹽水中短暫洗滌，中性甲醛固定。通過結扎右主支氣管，對大鼠進行左側單側肺灌洗，每次2 ml生理鹽水，灌洗肺泡3次后回抽放入EP管中，再抽取生理鹽水2 ml重復上述動作2次，每次灌洗后立即回吸，反復共3次，最終的回收量約為4.5 ml肺泡灌洗液(BALF)(回收率約75%)，將所有回吸液置于10 ml EP管中，立即進行離心，1 000 r/min，離心10 min，留取上清液，棄去細胞沉渣。分裝保存于-80 ℃備用。

1.2 病理學評估 肺組織經固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度為4 μm。切片后經脫蠟，梯度酒精復水，HE染色，在光學顯微鏡下進行觀察。計算標本平均肺泡數(MAN)及肺平均內襯間隔(MLI)：每組選取3只典型大鼠進行病理切片及HE染色，每張切片隨機鏡檢3個視野，在視野中心劃十字交叉線，計算劃線總長(L)、測量的視野面積(S)、計數與交叉線相交的肺泡隔數(NS)，以及計數各視野的肺泡總數(Na)，平均肺泡數MAN=Na/S；平均內襯間隔MLI=L/NS，表示肺泡平均內徑；二者用于測量大鼠肺氣腫的病理學嚴重程度。

1.3 酶聯免疫吸附(ELISA)法測定BALF中TNF-α及IL-8含量 按照ELISA試劑盒的說明進行操作，測定BALF中TNF-α及IL-8的含量。

1.4 免疫組化及Western檢測肺組織HIF-1α的表達 免疫組化染色按S-P試劑盒說明進行。右肺上葉用RIPA緩沖液(CST，馬薩諸塞州，美國)以100 mg組織∶1 ml裂解緩沖液的比例溶解。隨后4 ℃離心，條件為1 500×g，20 min。定蛋白后等量上樣，SDS-PAGE分離，隨后通過電印跡將蛋白質轉移到PVDF膜上。將膜在室溫下用封閉緩沖液[含0.1%Tween-20的3%脫脂牛奶在TBS(pH 7.4)]中封閉1 h，隨后在4 ℃下與抗HIF-Aα或β-actin的抗體孵育過夜，洗膜后二抗孵育2 h，使用Enhanced Chemiluminescence Plus試劑盒，并使用Las-3000發光圖像分析儀(Fujifilm，日本東京)進行分析。使用Image J軟件對條帶強度進行定量。相對于對照組中的水平計算蛋白質表達的倍數變化。

1.5 大鼠肺功能測定 依據文獻描述[6]測定0.3 s用力呼氣量(FEV0.3)以及0.3 s用力呼氣量占用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)。給予大鼠10%水合氯醛麻醉后，暴露氣管，置入Y型導管，描記大鼠平靜呼吸，在1次呼氣末注射6 ml空氣后，快速脫開，記錄FEV0.3及FEV0.3/FVC。

2 結果

2.1 病理形態學改變 在大體標本中，與C組相比較，CS組大鼠肺體積明顯增大，表面蒼白，局部可見肺大皰。使用紅霉素干預后，肺部肺氣腫改變明顯好轉(圖1A～圖1C)。

對比顯微鏡下病理學改變可見，與C組相對比，CS組大鼠氣道黏膜纖毛上皮倒伏，有不同程度的脫落，氣道被膜下腺體增生、肥大，杯狀細胞增多以及黏膜上皮形態改變，由柱狀逐漸扁平化，出現局部鱗狀上皮化生。肺內氣道壁及小血管周圍肺泡區周圍有炎癥細胞浸潤，肺泡管、肺泡囊及肺泡明顯擴大，肺泡壁可見斷裂。ERY+CS組可見肺氣腫形態的改善(圖1D～圖1I)。各組間MLI及MAN改變如圖1G～圖1H所示。與C組相比，CS組MLI及MAN均明顯擴大(P<0.05)；與CS組相比，ERY+CS組MLI及MAN均明顯好轉(P<0.05)。

圖1 紅霉素對香煙煙霧誘導大鼠肺氣腫改變的影響

2.2 BALF中TNF-α、IL-8蛋白的表達及大鼠肺功能結果 與C組比較，CS組大鼠BALF中炎癥介質TNF-α及IL-8表達均明顯增高(P<0.01)；經紅霉素干預后，炎癥介質TNF-α及IL-8表達有所降低(P<0.01)，見圖2A～圖2B。香煙煙霧暴露后，大鼠肺功能呈現明顯的阻塞性通氣功能障礙，FEV0.3及FEV0.3/FVC均降低(P<0.01)；經紅霉素干預治療后，大鼠肺功能明顯改善(P<0.01)，見圖2C～圖2D。

圖2 紅霉素對香煙煙霧誘導大鼠肺功能及BALF中炎癥介質表達的影響

2.3 HIF-1α表達結果 免疫組化及Western blot結果表明，香煙煙霧誘導后；大鼠肺氣腫組織中HIF-α蛋白表達均明顯增高(P<0.01)；紅霉素干預后，香煙煙霧誘導的HIF-α的增高較前降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 紅霉素對香煙煙霧誘導大鼠HIF-1α表達的影響

3 討論

HIF-1是細胞在缺氧條件下產生的一種轉錄因子，HIF-1由條件性表達的HIF-1α和結構性表達的HIF-1β兩個亞基組成，HIF-1α是其活性亞基，對氧分壓較敏感，正常氧分壓環境中HIF-1α極不穩定，容易降解，難以檢測[7]。低氧環境下，脯氨酸羥化酶活性被抑制，HIF-1α降解被抑制，從而轉移至胞核內，與HIF-1β形成HIF-1分子，發揮轉錄因子作用來調節靶基因表達[7]。

近年來國外對HIF-1α的研究顯示，其與炎癥反應有密切的聯系，機體乏氧后注射LPS，大鼠肺泡內間隔中性粒細胞數增高，炎癥反應更為明顯，LPS給藥6 h后，肝臟HIF-1α表達增加，3 h后血清IL-1β和CRP水平升高[8]。本實驗結果顯示，煙熏誘導肺氣腫模型大鼠肺組織中HIF-1α蛋白表達呈陽性，其表達水平與TNF-α呈正相關，與大鼠肺功能呈負相關，提示在煙霧暴露下也可使HIF-1α表達，HIF-1α可能參與了COPD慢性炎癥的發生、發展。與本研究結果相似，一項研究對比了COPD及非COPD患者的肺組織，COPD患者的肺組織中HIF-1α表達增加，且與VEGF及其受體的表達呈正相關[9]。另外，HIF-1α的表達增加反映了COPD的嚴重程度[9]。通過檢測患者BALF中HIF-1α、EGFR及炎癥因子的表達以及細胞的體外實驗發現，HIF-1α在COPD中過表達，通過激活EGFR/PI3K/AKT途徑上調了炎癥因子的表達[10]。COPD的肺部炎癥誘導激活的EGFR/PI3K/AKT通路進一步上調了反饋環中的HIF-1α表達，從而加劇了COPD的病理變化[10]。

迄今為止，多項基于大環內酯類藥物應用于COPD患者的研究均顯示，大環內酯類藥物治療可顯著減輕病情，可能有助于減輕這一群體的疾病負擔[11-13]。此外，與其他藥物共同使用時，紅霉素可以通過抑制PI3K/AKT途徑和增強HDAC2的活性來增強COPD模型大鼠中布地奈德的抗炎活性[14]。鑒于此，本研究對比分析了煙霧暴露后的大鼠肺氣腫經紅霉素干預后的效果及潛在機制。結果表明，應用紅霉素口服治療后，大鼠肺功能、肺部炎癥介質以及氣腫病理改變均得到改善，由香煙煙霧所誘導的HIF-1α增高也得到抑制，從而對肺部的炎癥及損傷起到保護性作用，且可能通過HIF-1α調控了相應的靶基因表達，從而發揮保護性作用。

綜上，小劑量紅霉素可通過調控抑制肺部HIF-1α的表達，從而發揮對香煙煙霧誘導的肺氣腫的保護性作用，進而改善患者的肺部炎癥反應，改善肺功能，發揮抗炎作用。