海南某三甲醫院多重耐藥銅綠假單胞菌MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM表達及與耐藥表型的關系研究

王生成，楊祚明，蔡瀟陽，張素領，王曉峰

0 引言

銅綠假單胞菌(Paeudomonasaeruginosa，Pa)屬于非發酵菌假單胞菌屬，是醫院內常見的條件致病菌之一，在呼吸科和ICU感染率高，常感染免疫力低下患者[1-5]。Pa對多種抗生素產生耐藥作用，給臨床治療帶來極大的挑戰，其臨床分離率僅次于大腸埃希菌[6]。Pa的耐藥機制復雜，外排泵系統在耐藥機制中發揮重要作用，目前發現的有7種外排泵系統。雖然目前研究者對外排泵系統的功能尚不完全清楚，但是已經認識到外排泵對Pa耐藥性的重要作用。有報道，外排泵可能通過將藥物泵出菌體外發揮耐藥作用[7]。研究發現，海南西部地區Pa的感染率較高，且其中4個外排系統MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM受到多種危險因素的調控[8-9]。由于檢測難度較大，我們參考上述文獻報道[8-9]對MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM 4個主動外排系統的表達情況及調控機制進行研究，以期為臨床治療提供思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 選取2016年9月至2018年10月儋州市人民醫院微生物培養室分離的Pa 54株，菌株均經法國生物-梅里埃公司所產的VITEK全自動微生物分析系統(BioMerieux)鑒定，其中多重耐藥(對2種或者2種以上抗生素耐藥)菌株36株，全部敏感菌株18株。參考菌株銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922，對照株Pa01，MexAB-OprM過度表達株CR1，MexXY過度表達株N135。

1.2 試劑和儀器 MH瓊脂購自青島海博生物技術有限公司，外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺(Phe-Arg-β-naph，PA βN)購自Sigma公司，抗菌藥物美羅培南購自日本鹽義制藥株式會社，其余13種抗菌藥物均購自中國藥品生物制品檢定所；TRIzol試劑盒、RNA反轉錄試劑盒購自中國大連TAKARA公司，SYBR GreenPCR Master Mix試劑盒購自美國Bio-Rad公司，DNA提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，Tap DNA聚合酶購自BioStar公司。DU-650紫外分光光度計購自美國Beckman公司，HZQ-F160全溫振蕩培養箱購自澳大利亞Corbett公司，低速高溫離心機、熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司，電泳儀購自北京六一儀器廠，ABI PRISM 3700測序儀。

1.3 抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)測定 按照CLSI 2014年規定的臨界標準判定每株Pa對抗菌藥物的敏感性，瓊脂稀釋法測定14種抗菌藥物對Pa的MIC。干預實驗測定耐藥菌株加外排泵抑制劑PA βN(終濃度為50 mg/L)對頭孢噻肟、慶大霉素、環丙沙星、亞胺培南的MIC。

1.4 Pa總RNA的提取 Pa單菌落接種于LB培養板中，過夜培養，嚴格按照TRIzol試劑盒說明書提取Pa總RNA。紫外分光光度計測定，記錄D260/280(RNA濃度)、D260/230(RNA純度)，根據測定值計算mRNA濃度。按照反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA，反應條件設置為30 ℃ 10 min，42 ℃ 30～50 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.5 RCR預實驗測定 反轉錄產物加無酶ddH2O稀釋10倍作為預實驗模板進行PCR反應，Primer Premier 5.0進行目的基因和內參基因的16SrRNA引物設計，引物序列如表1所示，由上海生工公司合成。PCR反應使用HS Ex Tap酶，反應條件設置為94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共進行30個循環，20 ℃ 5 min。反應結束后反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶單一產物表明反應產物專一，無二聚體，可繼續用于RT-PCR。

1.6 RT-PCR檢測膜融合蛋白mexA、mexC、mexE、mexX的mRNA表達水平 熒光定量PCR儀進行qRT-PCR檢測mexA、mexC、mexE、mexX的mRNA表達水平，引物序列根據文獻設計如表1所示[10]，反應體系為25 ml：Ultra SYBR Mixture 12.5 ml，cDNA 2.0 ml，上下游引物各0.5 ml，無RNA酶H2O 9.5 ml。SYBRGreen法熒光定量PCR參數設置為95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環。采用2-△△Ct法對所得數據進行分析，獲得半定量基因的表達量。

1.7 PCR擴增調控基因mexR、nfxB、mexT、mexZ及DNA測序 用煮沸法提取54株細菌的基因組DNA，分別擴增其調控基因mexR、nfxb、mexT、mexZ[11]。PCR反應體系為50 ml，PVR-magicMix 2.0 25 ml，DNA模板5，反應條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s,進行30個循環，72 ℃ 10 min。對擴增產物進行純化，以純化后產物送上海生工科技有限公司進行測序，測序結果使用Blast與GenBank已知序列進行比對，引物序列如表1所示。

表1 引物信息

2 結果

2.1 抗菌藥物最低抑菌濃度的測定 54株Pa中有36株為多重耐藥，18株為全部敏感株，對抗菌藥物的耐藥性、中介及敏感性如表2所示。其中耐藥性按照高低順序排列依次為：頭孢噻肟、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素、哌拉西林、環丙沙星、替卡西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、氨曲南、頭孢他啶、美羅培南、亞胺培南/西司他丁、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、阿米卡星。

表2 抗菌藥物耐藥性高低的比較

2.2 干預實驗結果 瓊脂稀釋法測定在PA βN干預下36株多重耐藥菌株的MIC，中位數法表示各組MIC值，23株對頭孢噻肟的敏感性由64～512 g/ml提高到4～256 g/ml，31株對慶大霉素的敏感性由1～64 g/ml提高到0.25～32 g/ml，26株對環丙沙星的敏感性由4～256 g/ml提高到1～64 g/ml，對亞胺培南的MIC降低為原來的1/4。見表3。

表3 抗菌藥物耐藥性高低的比較

2.3 膜融合蛋白基因的mexA、mexC、mexE、mexX的mRNA表達水平 外排泵系統在野生菌中低表達，本研究選擇野生菌株Pa01為參考，目的基因mexA、mexC、mexE、mexX的相對表達量高于參照株Pa01的相對表達量(9 544、1 028、110.556、72.12)即為高表達菌株。對多重耐藥菌株進行篩選，篩選出18株mexA高表達菌株，占總菌株數的33.33%(18/54)，篩選出9株mexC高表達菌株，占總菌株數的16.7%(9/54)，篩選出12株mexE高表達菌株，占總菌株數的22.22%(12/54)，篩選出14株mexX高表達菌株，占總菌株數的25.92%(14/54)；即18株Pa高表達MexAB-OprM外排系統，9株Pa高表達MexCD-OprJ外排系統，12株Pa高表達MexEF-OprN外排系統，14株Pa高表達MexXY-OprM外排系統。6株主動外排泵系統檢測陰性株，均無mexA、mexC、mexE、mexX的高表達。30株主動外排泵檢測陽性株及6株主動外排泵系統檢測陰性株的篩選試驗及基因表達水平結果如表4所示。

2.4 外排泵系統在多重耐藥Pa中的作用 瓊脂稀釋法測定加入抑制劑的Pa菌株對頭孢噻肟、慶大霉素、環丙沙星、亞胺培南的敏感性，18株MexAB-OprM外排泵高表達Pa株與低表達Pa株比較，對頭孢噻肟、慶大霉素、環丙沙星的MIC為2～64 μg/ml，9株MexCD-OprJ高表達株中6株對頭孢噻肟的敏感性MIC為2～128 mg/ml，12株MexEF-OprN中對環丙沙星、亞胺培南的敏感性MIC為4～128 mg/ml，14株MexXY-OprM為慶大霉素、環丙沙星高度耐藥菌株。

表4 36株Pa 4種泵出系統的表達情況及外排泵篩選試驗結果

2.5 mexR、nfxB、mexT、mexZ序列分析 分別隨機選擇mexA、mexC、mexE、mexX高表達菌株中的4個菌株，提取基因組DNA擴增其調控基因mexR、nfxB、mexT、mexZ，對擴增產物進行純化測序，并與GenBank中多對應序列進行對比。mexR高表達菌株中3個發生mexR基因突變，分別為第661位、第670位、第688位，第665位mexR編碼提前終止；4個nfxB高表達菌株中均發生82位的突變；4個mexT高表達菌株中均發生26位的突變；4個mexZ高表達菌株中2個發生138位的突變，一個發生50位的突變。突變結果如表5所示。

注：Ser：絲氨酸，serine；Gly：甘氨酸，glycine；Val：纈氨酸，valine；Gln：谷氨酰胺，glutamine；Asn：天冬酰胺，asparagine；Arg：精氨酸，agrinine；Leu：亮氨酸，leucine；His：組氨酸，histidine

3 討論

Pa中4個主動外排系統為MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM[11-12]，外排系統的作用主要依賴細胞膜上的主動外排蛋白，主要包括連接膜與相關外排蛋白的膜連接蛋白MexA、MexC、MexE、MexX，轉運抗生素作用的蛋白MexB、MexD、MexF、MexY，控制抗生素出入的外膜通道蛋白OprM、OprJ、OprN、Opr4。Pa的耐藥機制較為復雜，研究顯示，外排泵系統在耐藥機制中發揮重要作用，MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM外排泵系統均為RND家族，均由外膜蛋白、內膜轉運體、膜融合蛋白3部分組成。目前所涉及的耐藥機制主要有以下幾個方面：①外膜蛋白OprM等形成門通道，引起菌體包膜的通透性改變，使藥物排出菌體外；②內膜轉運體MexB、MexD等可識別藥物并將藥物主動排出細胞膜；③膜融合蛋白MexA、MexC等位于內外膜中間，連接內外膜。3種蛋白連接在一起形成一個連續通道，使進入菌體內的抗菌藥物從菌體內排除，藥物因達不到有效濃度而失效，且菌體對該種藥物產生耐藥性[13-15]。外排泵系統中的任何一部分失活都會引起菌株敏感性的提高[16]。

外排泵抑制劑具有抑制外排泵活性、減少細菌外排、提高抗菌藥物敏感性的作用。PA βN是一個低分子多肽，具有抑制外排泵表達的作用，還能夠降低Pa的侵襲性[17]。Coban等[18]研究表明，PA βN在16 mg/ml時，可以顯著降低對喹諾酮類耐藥的Pa對環丙沙星的MIC。本研究采用瓊脂稀釋法測定應用外排泵抑制劑Pa對抗菌藥物的MIC的改變。結果顯示，Pa對頭孢噻肟、慶大霉素、環丙沙星3種藥物的MIC均降低，表明添加抑制劑后可以降低外排泵的活性，提高菌體內藥物的有效濃度。

近年來研究發現，外排泵mRNA的表達水平可以反映蛋白表達水平[19]。故本實驗采用RT-PCR檢測4種外排系統中膜連接蛋白mexA、mexC、mexE、mexX的表達，結果顯示，36株多重耐藥菌株的mRNA表達水平均有所提高，且多個菌種表達不止一種外排泵系統，表明這些耐藥菌株的多重耐藥性可能是外排泵過度表達引起的。加入外排泵抑制劑后，可以發現耐藥菌株對頭孢噻肟、慶大霉素、環丙沙星、亞胺培南的MIC均有所下降，進一步證實抑制外排泵系統的活性可以降低Pa的MIC。

研究發現，外排泵系統過度表達受到上游調控基因的影響，基因的突變導致外排泵系統過度表達[20]。有報道，外排系統mexR編碼的MexR蛋白與MexAB-OprM的增強子結合，起到轉錄抑制的作用[21]。Nabl突變株中，mexR突變導致MexAB-OprM失去抑制表達增加，耐藥性增強[22]。本研究結果顯示，4個mexA高表達菌株中3個發生mexR基因突變；mexC高表達菌株中均發生nfxB的突變，mexE高表達菌株中均發生mexT的突變，mexX高表達菌株中3個發生mexZ的突變，表明外排泵系統的過度表達是受到調控基因突變的影響，引起氨基酸的變化，進而引起蛋白的變化。

綜上所述，多重耐藥Pa的MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM的過度表達是引起Pa多重耐藥的主導，且外排系統受到相應調控基因的影響。本研究尚存在不足之處，對每個外排系統的具體分子作用機制尚未研究清楚。