油用牡丹籽蛋白質的制備及理化性質研究

陳曉菲，蔡建紅，劉曉燕，任偉偉

0 引言

油用牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)屬毛茛科芍藥屬牡丹組木本植物。牡丹籽含油量20%以上；油脂中不飽和脂肪酸含量為80%～92%，其中α-亞麻酸含量為32%～67%，亞油酸含量為19%～35%[1-2]，牡丹籽油已被原國家衛生部批準為新資源食品。隨著近幾年我國油用牡丹種植面積的急劇擴大，油用牡丹產業蓬勃發展，隨之產生了大量的牡丹籽粕。牡丹籽粕蛋白質含量達25%，營養豐富[3]。因此，對牡丹籽粕蛋白進行研究，促進其精深加工與應用，具有極高的經濟價值和極大的營養保健價值[4]。

本文利用堿提酸沉提取牡丹籽蛋白質，并對提取工藝進行正交優化，同時就牡丹籽蛋白的理化性質進行研究，以期為牡丹籽的研究與開發提供理論基礎。

1 儀器與試藥

牡丹籽購買于山東菏澤堯舜牡丹生物技術有限公司，經南京中醫藥大學生藥學教研室鑒定為毛茛科芍藥屬牡丹的種子；考馬斯亮藍G250(北京索萊寶科技有限公司)；氫氧化鈉等其他試劑為分析純。WF-萬能粉碎機(江陰市康和機械制造有限公司)；紫外分光光度計UV7[梅特勒-托利多，國際貿易(上海)有限公司]；pHS-3C酸度計(上海雷磁儀器有限公司)；JY-SCZ2型雙垂直電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司)；DYY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠)。

2 方法

2.1 提取工藝流程 牡丹籽適當粉碎，95%乙醇脫脂，減壓過濾后晾干備用。精密稱取脫脂牡丹籽適量，加蒸餾水混勻，調節pH值至堿性，水浴加熱提取，離心，取上清，調節pH值至酸性，離心，棄上清，用蒸餾水洗滌沉淀至中性，冷凍干燥，即牡丹籽粗蛋白[4]。

2.2 蛋白質含量測定 分別精密移取牛血清蛋白標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 ml于試管中，補蒸餾水至1.0 ml，混勻，加5.0 ml考馬斯亮藍G250溶液，搖勻，靜置5 min，595 nm處測定吸光度。以蛋白標準溶液濃度(mg/ml)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線。以蛋白質含量(mg)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線。通過線性回歸得出方程為：Y=7.793 1 X+0.015 2，線性范圍為0～0.09 mg/ml，相關系數r=0.999 6。

2.3 單因素考察與正交優化 稱取2.0 g牡丹籽干粉若干份，分別選取液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(ml/g)]、提取時間(35、40、45、50、55 min)、pH值(9.0、9.5、10、10.5、11)、提取溫度(30、35、40、45、50 ℃)進行單因素試驗。在單因素試驗基礎上，采用正交試驗優化牡丹籽蛋白的提取工藝。

2.4 牡丹籽蛋白質理化性質研究

2.4.1 牡丹籽蛋白質紅外色譜 取冷凍干燥牡丹籽蛋白質樣品適量，與干燥KBr粉末充分研磨后壓片，于4 000～400 cm-1波段掃描。

2.4.2 牡丹籽蛋白質的分子量 目前測定蛋白質相對分子量常用的技術之一為SDS-PAGE電泳，按照Laemmli法[5]進行凝膠電泳，確定牡丹籽蛋白質相對分子量。電泳條件為：5%濃縮膠，12%分離膠，采用200 mA電流，進行2.5 h。

3 結果與討論

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 液料比對蛋白質提取量的影響 液料比對于牡丹籽蛋白質的提取量具有十分關鍵的影響。液料比過大，可能造成蛋白質的提取率降低；且其余雜質也容易一起提取出來，從而影響蛋白質純度，加大后續純化的難度。若液料比過小，容易出現蛋白質提取不充分的情況[6]。因此,本實驗在pH值為9、提取溫度50 ℃、提取時間50 min的條件下，考察液料比對牡丹籽蛋白質提取量的影響。如圖1所示，在料液比為10∶1～30∶1(ml/g)時，牡丹籽蛋白質提取量隨提取溶劑體積的增加而增大，當液料比為30∶1(ml/g)時，牡丹籽蛋白質提取量達到最大；隨著溶劑體積繼續增加，牡丹籽蛋白質提取量基本保持不變。

3.1.2 提取時間對蛋白質提取量的影響 提取時間是影響蛋白質提取量的重要因素之一。若提取時間過短，容易出現蛋白質提取不充分的情況，造成資源的浪費。若提取時間過長，可能會導致蛋白質的結構發生改變，影響蛋白質的提取率和穩定性。因此，在pH值為9、提取溫度50 ℃、液料比30∶1(ml/g)的條件下，考察提取時間對牡丹籽蛋白質提取量的影響。如圖2所示，在35～45 min內，蛋白質提取量隨提取時間增加而增大，在提取時間為45 min時，提取量達到最大。當提取時間超過45 min后，牡丹籽蛋白質提取量逐漸降低。

圖1 液料比對蛋白質提取量的影響

圖2 提取時間對蛋白質提取量的影響

3.1.3 pH值對蛋白質提取量的影響 由圖3可知，在一定pH值范圍內，牡丹籽蛋白質提取量隨pH值升高不斷增大，當pH值超過10.0時，蛋白質含量下降，可能因為隨溶液pH值的升高，改變了蛋白質表面帶電情況。在堿性溶液中，蛋白質所帶負電荷增加，影響了蛋白質與溶劑之間或者蛋白質分子與分子之間的相互作用，影響其溶解性[7]。

3.1.4 提取溫度對蛋白質提取量的影響 提取溫度是影響蛋白質提取量的重要因素之一。若提取溫度過低，則蛋白質提取效率較低。若提取溫度過高，致蛋白質的結構發生變性，影響蛋白質的生物活性和穩定性[8]。因此，在pH值為9、液料比30∶1(ml/g)、提取時間50 min的條件下，考察提取溫度對牡丹籽蛋白質提取量的影響。如圖4所示，在提取溫度為30～40 ℃，牡丹籽蛋白質提取量隨溫度增加不斷增大，溫度超過40 ℃，蛋白質含量降低。

圖3 pH值對蛋白質提取量的影響

圖4 提取溫度對蛋白質提取量的影響

3.2 正交試驗結果 由表1～表3可知，以牡丹籽蛋白質提取量為指標，影響提取牡丹籽蛋白質提取量的4個因素中，液料比影響最大，其次是提取時間、提取溫度，pH值影響最小，即C>B>D>A。牡丹籽蛋白質提取較優方案為A3B1C2D2，即pH值為10.5，提取40 min，液料比25∶1(ml/g)，提取溫度40 ℃。

表1 牡丹籽蛋白質提取工藝因素水平表

3.3 牡丹籽蛋白質理化性質研究

3.3.1 牡丹籽蛋白質紅外色譜分析 由圖5可知，在3 395.79 cm-1強而寬的吸收峰為N-H鍵的伸縮振動，在2 933.19 cm-1處吸收峰為費米共振，在1 655.68 cm-1處強吸收峰為C=O鍵的伸縮振動，1 536.10 cm-1處為N-H彎曲振動和C-N伸縮振動吸收峰，1 322.25、1 281.50、1 238.61 cm-1處為C-N和N-H彎曲振動吸收峰，594.82 cm-1處吸收峰為C=O面外彎曲振動吸收峰。

表2 L9(34)正交實驗結果

表3 方差分析

注：F0.05(1,2)=19

圖5 牡丹籽蛋白質紅外色譜圖

3.3.2 牡丹籽蛋白質的分子量 牡丹籽蛋白質的分子量主要集中在66.2～18.4 kDa范圍內，主要有66.2～45.0 kDa和25.0～18.4 kDa 3條帶組成，牡丹籽蛋白質的分子量大約為55、51、22 kDa。

見圖6。

圖6 牡丹籽蛋白質SDS-PAGE電泳圖

4 結論

本研究結果表明，牡丹籽蛋白質提取的最佳工藝條件為pH 10.5，提取40 min，液料比25∶1(ml/g)，提取溫度40 ℃，研究發現，牡丹籽蛋白質的分子量主要集中在66.2～18.4 kDa，為牡丹籽蛋白質的開發與利用提供基礎。