基于證素辨證的絕經后骨質疏松癥代謝組學研究

李肖飛，徐琬梨

（山東中醫藥大學，濟南 250355）

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis,PMOP）是由于女性在絕經后激素水平快速下降從而導致骨含量降低而出現的。絕經后骨質疏松癥是女性需要重點關注的疾病，其對女性的健康存在重要的影響，引起了社會上的廣泛關注。本文對絕經后骨質疏松癥患者的常見證素以及正常對照組進行代謝組學分析，以期為絕經后骨質疏松癥的臨床診斷及預防提供生物學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集在山東中醫大學附屬醫院山東省中醫院骨科2016年12月－2017年10月住院并測定骨密度確定為骨質疏松癥的患者，并通過證候辨證素量表測得絕經后骨質疏松癥常見實性證素（腎虛組、痰濕組、腎虛氣滯組、腎虛痰濕組、腎虛血瘀組），以及空白對照組患者。各組在年齡、性別、絕經年齡等方面比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 診斷標準 參照《原發性骨質疏松指南（2017）》[1]擬定。1）女性絕經1年以上；2）骨質疏松癥診斷主要參考脆性骨折程度或DXA骨密度測量結果，T-值≤-2.5可診斷為骨質疏松；3）既往無糖尿病、甲亢、甲旁亢等影響骨代謝性疾病、血液系統疾病、慢性肝腎功能不全、惡性腫瘤疾病史及無長期接受糖皮質激素及免疫抑制劑治療。

1.3 證素診斷標準 根據中醫理論和辨證思維規律，參照《證素辨證學》[2]，根據中醫診斷整體審察、四診合參的原則，對證候、證素進行文獻查閱、數據分析，對其2者所存在的從屬關系，進行量化標值，從而制定出“證候辨證素量表”。通過臨床信息采集對患者進行量表的測評，根據四診進行判斷各個證候，以明確在證素診斷中所占的評分比重，以各證候的評分總分來確定證素。取病位證素腎，以腎虛為主要臨床表現，綜合實性證素血瘀、氣滯、痰濕，分為腎虛組、痰濕組、腎虛血瘀組、腎虛氣滯組、腎虛痰濕組，每組各30例。

1.4 血清采樣方法 晨時空腹取血，室溫下離心5 min后取血清，至-80℃的冰箱進行分組儲存。

1.5 樣本預處理 將血樣樣本在室溫下解凍，取血樣樣本400 μL放于1.5 mL離心管中，加入30 μL緩沖液和170 μL水，斡旋混勻，震蕩混勻后在4 ℃的條件下離心10 min，取500 μL上清液至核磁管中待檢。

1.6 H-NMR數據采集及處理 H-NMR 實驗所用儀器是Varian 600MHz 譜儀，其1H共振頻率是599.93 MHz。橫向弛豫加權實驗是用水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列，弛豫延遲2.0 s，采集時間1.5 s，譜寬12 000.0 Hz，溫度25 ℃，總回波時間100 ms，累加次數64次。

1.7 統計學方法 采用MestReNova 9.0.1對H-NMR采集處理的數據進行分析，進行多元統計分析，主要包括主成分分析（PCA），進一步用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）優化組間差異，通過對OPLS-DA模型各代謝物相應的相關系數分析，對有統計意義的差異代謝物進行進一步歸納。

2 結果

2.1 H-NMR譜圖預處理 對各組血清的譜圖使用MestReNova V9.0.1進行相位調整、傅立葉變換、基線定標及校正等處理[3]，結果顯示見圖1。通過分析圖譜可知各組之間存在差異代謝物，繼續采用多元統計方法進行分析，包括PCA、PLS-DA和OPLS-DA。

本研究中主要研究A、C、D、E、F組之間的差異。通過檢索代謝組學H-NMR譜相關化學位移譜數據庫，可知各組血清的差異代謝物主要如下。1-MH：1-甲基丁酸；3-HB：3-羥基丁酸；AA：乙酰乙酸；Ace：乙酸；Act：內酯；Ala：丙氨酸；Cho：膽堿；Cit：檸檬酸；Cr：肌酸；DMA：二甲基賴氨酸；DMG：N，N-二甲基甘氨酸；EA：乙醇胺；Eth：乙醇；For：甲酸；Glc：葡萄糖；Gln：谷氨酰胺；Glu：谷氨酸；Gly：甘氨酸；G：丙三醇l；GPC：甘油磷酸膽堿；HDL：高密度脂蛋白；HX：次黃嘌呤；IB：異丁酸；Ile：異亮氨酸；L1：低密度脂蛋白,CH3-（CH2）n-；L2：極低密度脂蛋白，CH3-（CH2）n-；L3：低密度脂蛋白，CH3-（CH2）n-；L4：極低密度脂蛋白，CH3-（CH2）n-；L5：極低密度脂蛋白，-CH2-CH2-C=O；L6：脂質，-CH2-CH=CH-；L7：脂質，-CH2-C=O；L8：脂質，=CH-CH2-CH=；L9：脂質，-CH=CH-；Lac：乳酸鹽；Leu： 亮氨酸；Lys：賴氨酸；M： 丙二酸；Met： 甲硫氨酸；Mol： 甲醇；m-I：肌醇；NAG：N-乙酰糖蛋白；PC：磷酸膽堿；Phe： 苯丙氨酸；Py：丙酮酸；Sar： 肌氨酸；Suc：琥珀酸鹽；Thr：蘇氨酸；TMAO： 三甲胺；Tyr： 酪氨酸；Val： 纈氨酸。

2.2 主要成分分析 PCA可以更好的揭示各組的內部結構，從而更明確的說明各組數據變量。使用SIMCA 14.1，對實性證素各組結果進行對數（LOG）轉換加UV格式化處理，然后進行自動建模分析[4]。從A、F組，A、E組，A、D組，A、C組之間PCA得分圖的結果可以看出，2組樣本區分不顯著，樣本大部分處于99%置信區間（Hotelling’s T-squared ellipse）內，此數據值得進一步研究。

2.3 正交偏最小二乘法一判別分析（PLS-DA）及對模型的驗證 為了實驗結果的可視化和后續分析，采用OPLS-DA的方法進行進一步的數據分析。使用SIMCA 14.1對數據進行LOG轉換加UV格式化處理[5-6]，表明各組之間模型可靠，并且各組血清代謝模式發生改變。可知C、A組，D、A組，E、A組，F、A組各組之間的置換檢驗結果表明各組模型的R2接近1，表明建立的模型符合樣本數據的真實情況Q2接近1，說明如果有新樣本加入模型，會得到近似的分布情況，總的來說各組的原模型可以很好地解釋2組樣本之間的差異。

圖1 各組血清譜峰歸屬圖

2.4 差異代謝物的篩選 通過對OPLS-DA模型各代謝物相應的相關系數分析，對有統計意義的代謝物進行進一步歸納。對數據進一步處理時，先將相關系數圖中的所有變量的Loading值乘以其標準偏差后，進行回溯轉換對各組的數據，相關系數的絕對值與0.361進行對比，最終篩選獲得導致各組之間存在差異的代謝產物[7-8]。見表1。

結果顯示絕經后骨質疏松癥的腎虛組與正常對照組，腎虛氣滯組與正常對照組，腎虛血瘀組與正常對照組，腎虛痰濕組與正常對照組之間的血清代謝成份存在明顯的差異。1）PMOP腎虛組與正常對照組主要的差異代謝物為乙醇胺、甲酸鹽、次黃嘌呤、異亮氨酸、丙二酸鹽、酪氨酸、纈氨酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖，差異具有統計學意義（P＜0.05）；2）PMOP腎虛氣滯組與正常對照組主要的差異代謝物為肌酸、乙醇胺、甲酸、谷氨酰胺、異丁酸、異亮氨酸、乳酸鹽、低密度脂蛋白、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸，差異具有統計學意義（P＜0.05）；3）PMOP腎虛血瘀組與正常對照組主要的差異代謝物為乙醇胺、甲酸、異丁酸、異亮氨酸、低密度脂蛋白、亮氨酸、丙二酸鹽、酪氨酸、纈氨酸，差異具有統計學意義（P＜0.05）。4）PMOP腎虛痰濕組與正常對照組主要的差異代謝物為甲酸、甘油、丙酮酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 不同組對間血清主要差異代謝物及其OPLS-DA相關系數

3 討論

通過對絕經后骨質疏松癥實性證素進行HNMR的代謝組學研究，血清樣本的譜圖上有很多不同的尖銳譜峰，并且通過PCA、PLS-DA、OPLS-DA的分析，可知腎虛組與正常對照組，腎虛氣滯組與正常對照組，腎虛血瘀組與正常對照組，腎虛痰濕組與正常對照組之間存在明顯的差異代謝物。

3.1 腎虛組與正常對照組的差異代謝物分析 乙醇胺與糖酵解有關，乙醇胺是磷脂代謝的產物，磷酸是體內各種物質代謝不可缺少的物質，乙醇胺的增加說明磷脂代謝的增加，磷脂代謝與腎病糖尿病相關，其乙醇胺的增多反應其病位腎部位的病理變化[9]。亮氨酸、異亮氨酸是支鏈氨基酸,能夠促進和抑制蛋白質合成、分解，并且參與糖代謝過程，與機體能量代謝有關[10]。低密度脂蛋白參與脂代謝的運程，與骨質疏松癥的發生存在關聯，其含量的降低說明體內脂代謝運程的降低。纈氨酸與體外細胞免疫有關[11]。說明腎虛組的能量代謝較慢，PMOP腎氣虛患者會影響能量代謝、脂代謝的進程，腎虛證的表現與代謝物的異常相符合，并且表明PMOP腎虛患者的細胞外免疫力下降。甲酸是甲醇的代謝產物，甲醇經過肝臟的代謝生成甲酸。生成的甲酸最初會聚集于眼部，破壞視覺神經，造成視覺上的變化，后期隨著身體氣血循環進入血液會使組織酸性變強，進而損害腎臟，造成腎臟功能的降低。BROSNAN等[12]研究發現甲酸由多種代謝源產生，主要用于嘌呤合成，通過對葉酸缺乏大鼠甲酸鹽代謝的研究表明，葉酸缺乏導致甲酸鹽產生率降低，同時血漿甲酸鹽濃度升高。研究[13]表明葉酸水平的升高會導致骨質疏松癥的發生，因此甲酸含量的上升與骨質疏松癥存在關聯。

3.2 腎虛氣滯組與正常對照組的差異代謝物分析 肌酸是甘氨酸的衍生物，在能量代謝上具有重要作用。其存在于肌肉中，與人體運動、力量、恢復等相關[14]。谷氨酸含量的降低與人體疼痛反應降低相關[11]。乳酸是糖異生循環中的主要原料，乳酸含量的異常說明PMOP腎虛氣滯患者由于氣機的阻滯使循環系統受到影響[15]。賴氨酸是所有慢性病常見的代謝物，苯丙氨酸主要在肝臟等組織中代謝成酪氨酸，參與酪氨酸降解途徑[16]，其含量的異常說明PMOP是一種慢性疾病。中醫學中氣滯的發生多與肝臟有關，因此PMOP腎虛氣滯組相比對照組會影響糖代謝、氨基酸代謝等方面，尤其在于氨基酸代謝的紊亂，并且其代謝物的異常提示對人體消炎鎮痛方面存在影響。

3.3 腎虛血瘀組與正常對照組的差異代謝物分析 酪氨酸是合成兒茶酚胺類遞質的前體，兒茶酚胺遞質可以緩解疼痛達到消炎鎮痛的目的，酪氨酸含量的異常表明PMOP患者需要該類物質來達到自身修復的作用[17]，說明PMOP血瘀組患者所表現出來的刺痛與體內酪氨酸的增多有關。PMOP腎虛血瘀組的乙醇胺的含量也是上升的，表明對于PMOP的患者的糖代謝有影響。該組低密度脂蛋白差異代謝值較其他組上升最大，LDL水平的增高說明脂代謝的異常，脂肪不完全氧化程度高，血液運行緩慢，低密度脂蛋白的上升則與血瘀證相符[18]。纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸的含量也是上升的，其都屬于氨基酸代謝[19]，多于肝臟進行，同樣表明血瘀的發生與肝存在聯系。

3.4 腎虛痰濕組與正常對照組差異代謝物分析 葡萄糖進行有氧糖酵解，1分子的葡萄糖可以提供2 mol ATP和2分子的丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸，丙酮酸與人體的能量代謝相關[10]，另一方面丙酮酸與激素的形成存在關聯，而PMOP發生的重要原因是激素水平紊亂，因此丙酮酸含量的異常也會導致PMOP的發生。α-葡萄糖，β-葡萄糖也是細胞能量來源的產物以及中間的代謝物[20]，說明PMOP腎虛痰濕組的糖代謝較為迅速，糖異生的過程加快，中間產生乳酸含量較低，表明一方面痰濕證會令人感到乏力，疲倦的感覺[21]。另一方面，痰濕證會阻礙布散人體所需的精微物質。

4 結論

通過對PMOP各組以及正常對照組血清的差異代謝物進行研究分析，可知PMOP各組與正常組是可以區分的，涉及19種差異代謝物，其中甲酸代謝物的變化與各組都相關，可能是PMOP較為明顯的潛在生物學標志物。為PMOP的發病機理研究提供了生物學上的支持，提示在PMOP的研究中應把重點放在甲酸代謝物方面，分析其所在通路以及所涉及基因，也表明生活中出現一些疼痛以及飲食異常的情況要加以重視。本實驗研究主要用的是HNMR技術，只能檢測小部分血清代謝物，以后的研究中可以進一步采取CS-MS、LC-MS的檢測，來提高檢測的準確性，為PMOP研究發病機理提供生物學依據。