海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑的研制

陳茹 曹雪梅 吳海霞 李歡 陳新元 暴增海 馬桂珍 王軍強

摘要 以海洋多黏類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa為研究對象，通過單因素室內試驗和田間試驗，確定了可濕性粉劑配方及其對甜瓜枯萎病的田間防效。結果表明，可濕性粉劑最佳配方為：以皂土為載體的菌粉70%，穩定劑海藻酸鈉14%，濕潤劑蔗糖脂肪酸酯8%，分散劑聚乙烯醇8%。制得的可濕性粉劑活菌數為1.23×1010cfu/g，含水量6%，潤濕時間48 s，懸浮率75%，雜菌率0。采用7種不同方法防治甜瓜枯萎病，結果表明，可濕性粉劑對甜瓜枯萎病的綜合防治效果高達84.9%。該制劑對甜瓜枯萎病具有良好防效，可作為防治甜瓜枯萎病的藥劑在生產上推廣應用。

關鍵詞 多黏類芽胞桿菌; 可濕性粉劑; 篩選; 田間防治

中圖分類號： S 482.292

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019161

Abstract

Paenibacillus polymyxa was used to study the composition of wettable powder and its field control effect on melon wilt by single factor test in laboratory and field experiments. The optimum formula of the wettable powder was： 70% bacterial powder with bentonite as carrier， 14% sodium alginate as stabilizer， 8% sucrose fatty acid ester as wetting agent and 8% polyvinyl alcohol as dispersant. The number of living bacteria in wettable powder was 1.23×1010 cfu/g， water content 6%， suspension rate 75%， wetting time 48 s and heterogeneous bacteria rate 0%. Seven different methods were used to prevent melon wilt and the results showed that the comprehensive control effect on melon wilt was up to 84.9% by wettable powder. The preparation had a good control effect against melon wilt， and can be popularized and applied as a medicament for controlling melon wilt.

Key words

Paenibacillus polymyxa; wettable powder; screening; field control

甜瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌甜瓜專化型Fusarium oxysporum f.sp.melonis侵染引起的一種土傳病害[1]，嚴重影響甜瓜的產量和品質，造成經濟損失。目前甜瓜枯萎病的防治主要依賴化學農藥，化學防治不但防效差而且會導致一系列的問題，如食品中化學農藥殘留超標、環境污染和病原菌產生抗藥性等[24]。因此，研制新型高效、環保、安全的微生物制劑成為防治植物病害的研究熱點[5]。

多黏類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa是一種廣泛存在的重要微生物資源，其中很多菌株作為重要的生防資源，用于多種植物病害的生物防治，該菌對人畜安全、無環境污染、對植物非致病性，具有顯著的生防潛力和環境適應性[6]，在生產過程中活菌量高且產品穩定性強，是目前進行微生物農藥規模化生產的理想生防菌。Kim等[7]研究發現，多黏類芽胞桿菌GBR-462菌株能夠有效地抑制灰霉病等病害的致病菌生長，在農業生產中具有較高的應用價值。宋永燕等[8]采用平板擴散法測定了多黏類芽胞菌LM-3菌株抗菌蛋白對稻瘟病菌和水稻紋枯病菌的抑制作用，并研究了菌懸液浸種、浸芽和澆苗3種處理方法對水稻的促生作用和對超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶3種保護酶的誘導表達作用。陳海英等[9]研究表明多黏類芽胞桿菌CP7菌株分泌抑菌物質對荔枝霜疫霉菌具有很強的抑制作用。2002年，美國環境保護署（EPA）將多黏類芽胞桿菌列為商業上可應用的微生物種類之一[10]。

近年來有關防治植物病害的微生物制劑研究報道日益增加。由華東理工大學與上海澤元海洋生物技術有限公司聯合創制的多黏類芽孢桿菌可濕性粉劑對番茄、辣椒、茄子及煙草青枯病具有較好抑制作用，且已經實現工業化生產及應用[11]。李磊等[12]通過室內篩選和田間試驗，確定解淀粉芽胞桿菌Ht-q6可濕性粉劑的最佳配方以及對番茄葉霉病和灰霉病的田間防效。徐玲等[13]通過室內盆栽試驗結果表明，HY96-2的生防制劑KDLD對番茄青枯病的防治效果可達81.5%。

目前，國內外甜瓜枯萎病的生物防治主要是利用陸源微生物進行防治，而采用海洋微生物防治的報道較少，且以海洋多黏類芽胞桿菌為有效成分的微生物活菌制劑防治甜瓜枯萎病的研究未見報道。本研究所采用的海洋多黏類芽胞桿菌是本實驗室從連云港海域分離得到的一株對多種植物病害具有較強抑制作用的優良菌株[1416]，本文在實驗室前期研究基礎上又進行了1 t發酵罐的放大試驗，使其有效成分含量遠高于同類產品，具有廣闊的應用前景和發展潛力。本試驗旨在為該菌株篩選出最佳載體和助劑以制備成可濕性粉劑，為其工業生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

海洋多黏類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa L1-9菌株由本實驗室在連云港海域中分離純化并保存。

1.2 培養基

菌株活化培養基：PDA培養基;種子液培養基：PD培養基。

1.3 載體和助劑

載體：鈣基膨潤土（天津市光復精細化工有限公司）、皂土（天津市巴斯夫化工有限公司）、高嶺土（天津科密歐化學試劑有限公司）、碳酸氫鈣（南京化學試劑有限責任公司）、活性白土（國藥集團化學試劑有限公司）、硅藻土（上海聯邁生物工程有限公司）、凹凸棒土（上海聯邁生物工程有限公司）;穩定劑：熒光素鈉（國藥集團化學試劑有限公司）、硬脂酸鋅（南京化學試劑有限責任公司）、腐植酸（國藥集團化學試劑有限公司）、黃原膠（南京化學試劑有限責任公司）、海藻酸鈉（南京化學試劑有限責任公司）、硬脂酸鈣（上海譜振生物科技有限公司）;濕潤劑：脂肪醇聚氧乙烯醚25（上海譜振生物科技有限公司）、蔗糖脂肪酸酯（合肥巴斯夫生物科技有限公司）、吐溫80（南京化學試劑有限責任公司）、乙氧基化烷基硫酸鈉（無錫市亞泰聯合化工有限公司）、十二烷基苯磺酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）、木質素磺酸鈉（南京化學試劑有限責任公司）;分散劑：聚乙烯醇（南京化學試劑有限責任公司）、羧甲基纖維素納（國藥集團化學試劑有限公司）;展著劑：柱層析硅膠（青島海洋化工有限公司）、薄層層析硅膠（青島海洋化工有限公司）。以上載體和助劑均為分析純。

1.4 種子液制備

將海洋多黏類芽胞桿菌接種到PDA培養基上活化24 h，在無菌條件下用接種環挑取海洋多黏類芽胞桿菌于裝有60 mL種子液培養基的250 mL三角瓶中，28℃，180 r/min振蕩培養16 h;調整菌液濃度為108 cfu/mL，作發酵用種子液。

1.5 可濕性粉劑載體和助劑的篩選

1.5.1 不同載體和助劑與海洋多黏類芽胞桿菌生物相容性的測定

將制備好的種子液取6 mL分別接入裝有60 mL含4%載體和助劑的PD培養基的250 mL三角瓶中，在28℃，180 r/min的條件下培養24 h，用稀釋涂布計數法檢測培養液中的含菌量。每個處理3個重復。根據活菌數量判斷不同載體和助劑與海洋多黏類芽胞桿菌的生物相容性。

1.5.2 可濕性粉劑載體和助劑種類的篩選

載體對海洋多黏類芽胞桿菌吸附量的測定：分別向100 mL燒杯中加入不同載體各2 g，將海洋多黏類芽胞桿菌的發酵液緩慢滴加于燒杯中，滴加的同時用玻璃棒攪拌。當載體粉末開始凝結成團且不散開時，停止向其中繼續滴加發酵液。記錄滴加到載體中的發酵液的量。每種載體3個重復。

載體和助劑懸浮率測定采用國家標準農藥可濕性粉劑懸浮率測定方法[17]。

載體和助劑潤濕性采用國家標準農藥可濕性粉劑潤濕時間測定方法[18]。

1.5.3 可濕性粉劑加工載體與助劑配比及用量篩選

篩選出的穩定劑與海洋多黏類芽胞桿菌的新鮮干粉按1∶5、1∶10、1∶20的質量比混合均勻。分別在放置5、10、15 d時稱取不同配比的試樣測定活菌數。確定穩定劑的配比。

將篩選出的最佳濕潤劑、分散劑和展著劑按不同的比例混合，粉碎機混合均勻后過325目篩，測定其潤濕時間和懸浮率，篩選出濕潤劑、分散劑和展著劑的最佳質量配比。將篩選出的最佳質量配比的分散劑和潤濕劑按2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的不同用量添加到海洋多黏類芽胞桿菌的新鮮菌粉中。綜合考慮潤濕性和懸浮效果，篩選出濕潤劑、分散劑和展著劑的最佳用量。

1.6 可濕性粉劑的制備及性質測定

1.6.1 菌粉的制備

海洋多黏類芽胞桿菌在1 t發酵罐中按優化的發酵條件進行發酵，將篩選出的載體以及絮凝作用的物質添加到發酵液中，進行吸附，板框過濾后，得到菌餅，自然晾干粉碎后得到菌粉。

1.6.2 可濕性粉劑的加工及其性質測定

按照優化的海洋多黏類芽胞桿菌菌粉與助劑比例加入優化篩選出的穩定劑、濕潤劑和分散劑，混合均勻，粉碎后過325目篩，得到海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑，按照國家可濕性粉劑的標準測定懸浮率、潤濕時間和含水量，將制得的海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑存放于室溫條件下（25℃），120 d前每15 d，120 d后每30 d取樣，采用平板計數法測定保存不同時間樣品的活菌數。

1.7 海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑不同處理方法防治甜瓜枯萎病的田間藥效試驗

選擇甜瓜枯萎病發病較重地區試驗地進行田間藥效試驗。試驗小區按隨機區組排列，每小區移栽2行甜瓜，行距為65 cm，株距為29 cm。在盆栽試驗不同方法最適用藥濃度的基礎上，設計拌種、拌土、灌根、拌種+拌土、拌種+灌根、拌種+拌土+灌根、拌土+灌根等7種施藥方法。拌種法：取甜瓜種子質量3%的海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑對甜瓜種子進行拌種后催芽，接種至土壤中。拌土法：制備質量分數為30%的含藥土壤，采用下鋪上蓋的處理方式將含生防制劑的土壤添加到甜瓜床的土壤中，種植甜瓜時鋪上500 g含藥劑土壤后播種露白的種子，種子上再蓋上500 g含藥劑土壤。灌根法：甜瓜生長至子葉期時用20%海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑溶液進行灌根處理[19]。7種處理使用以上3種方法及濃度分別對甜瓜進行處理。每種處理3次重復，分別以3%多抗霉素可濕性粉劑（山東魯抗生物農藥有限責任公司）（CK1）和清水（CK2）作對照，最后1次施藥后10 d進行第1次調查，之后每隔10 d進行1次藥效調查。記錄發病率和病情指數，計算防效。甜瓜收獲后不同小區單獨測產，分別記錄單瓜質量、每株果實數及20株產量，計算保產率。

病情指數=∑（各級病苗數×各級代表值）調查總數×最高級代表值×100;

防病效果=CK病情指數-處理病情指數CK病情指數×100%;

保產率=處理產量-CK產量CK產量×100%。

2 結果與分析

2.1 可濕性粉劑載體和助劑的篩選

2.1.1 載體的篩選

添加4%皂土的發酵液中的活菌數最高，為1.22×1010 cfu/mL，在與菌株一起混合培養的載體中，皂土與海洋多黏類芽胞桿菌的生物相容性最好，其對海洋多黏類芽胞桿菌具有促生作用（表1）。

本試驗中所選載體對海洋多黏類芽胞桿菌的吸附效果差異顯著，其中皂土對海洋多黏類芽胞桿菌菌液的吸附效果最好，平均吸附量可達2.333 mL/g，其吸附量顯著多于其他載體（表2）。添加皂土的制劑潤濕時間最短，為25 s，懸浮率也最高，為87%（圖1）。綜上所述，本試驗選擇皂土作為海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑的載體。

2.1.2 穩定劑的篩選

不同的穩定劑與海洋多黏類芽胞桿菌生物相容性有明顯差異。與菌株混合培養的穩定劑中，添加4%海藻酸鈉的發酵液活菌數最高，為1.76×1010 cfu/mL（表3），顯著高于對照，說明該穩定劑對多黏類芽胞桿菌具有促生作用。

不同穩定劑對制劑性能有明顯的影響。添加不同穩定劑的潤濕時間由短到長的順序為：硬脂酸鈣<海藻酸鈉<熒光素鈉<腐植酸<硬脂酸鋅<黃原膠，添加硬脂酸鈣的潤濕時間最短，為63 s;海藻酸鈉、熒光素鈉次之。海藻酸鈉的懸浮率最高，為81%，懸浮效果最佳;其次是熒光素鈉、硬脂酸鈣（圖2）。綜合考慮穩定劑與海洋多黏類芽胞桿菌的生物相容性、潤濕時間和懸浮率，選擇海藻酸鈉作為制劑的穩定劑。

2.1.3 濕潤劑的篩選

添加4%濕潤劑與菌株混合培養的發酵液中，活菌數與空白對照相比都有明顯增加，說明幾種濕潤劑對海洋多黏類芽胞桿菌均具有促生作用。其中添加蔗糖脂肪酸酯的發酵液中的活菌數最高，為8.98×109 cfu/mL（表4）。

添加不同濕潤劑對制劑的濕潤時間和懸浮率有明顯影響（圖3）。添加蔗糖脂肪酸酯時潤濕時間最短，潤濕時間為9 s，懸浮率也最高，為80%。綜上所述，本試驗選擇蔗糖脂肪酸酯作為制劑的濕潤劑。

2.1.4 分散劑、展著劑的篩選

添加4%不同分散劑與海洋多黏類芽胞桿菌混合培養，其生物相容性有明顯的不同。由表5可以看出，供試分散劑聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉和柱層析硅膠與海洋多黏類芽胞桿菌有較好的生物相容性，對菌株的生長都表現了一定的促進作用;而薄層層析硅膠與海洋多黏類芽胞桿菌的生物相容性較差。

添加不同分散劑的制劑懸浮率均比較高，表明分散劑能顯著提高海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑的懸浮性，添加分散劑聚乙烯醇的懸浮率最高，為80%，懸浮時間最短，為10 s。添加展著劑柱層析硅膠和薄層層析硅膠的懸浮率較低，濕潤性差。因此在制劑制備的過程中不添加展著劑（表6）。

綜合考慮以上篩選結果，選擇聚乙烯醇作為海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑的分散劑。

2.2 可濕性粉劑載體與助劑配比及用量篩選

2.2.1 穩定劑配比的篩選

菌粉與穩定劑海藻酸鈉的配比不同，保存相同天數活菌數的減少量也不同。存放15 d時，不添加穩定劑海藻酸鈉的制劑中活菌數最少，為9.07×108cfu/g，添加不同配比穩定劑海藻酸鈉的制劑活菌數均明顯高于空白對照，說明添加穩定劑海藻酸鈉提高了制劑的穩定性。當菌粉與穩定劑的配比為5∶1時，制劑存放15 d時活菌數最多，說明當菌粉與穩定劑的配比為5∶1時，穩定性最佳。因此可以確定菌粉與穩定劑的最優配比為5∶1（表7）。

2.2.2 濕潤劑與分散劑的質量配比對制劑性質的影響

隨著分散劑聚乙烯醇的增加，制劑的懸浮率提高，同時制劑的潤濕時間也隨之變長（表8）。說明濕潤劑與分散劑的質量配比對制劑性質有顯著影響，分散劑質量的增加顯著提高了制劑的懸浮率，同時濕潤劑質量的減少顯著延長了濕潤時間。

綜合考慮潤濕性與懸浮性，選擇分散劑與濕潤劑的質量配比為5∶5。

2.2.3 濕潤劑與分散劑的用量對制劑性質的影響

濕潤劑與分散劑的用量對制劑性質有明顯的影響（表9）。隨著濕潤劑和分散劑添加量的增加，制劑的懸浮率隨之提高，潤濕時間變短。說明增加濕潤劑與分散劑的用量將提高制劑的懸浮性和潤濕性。同時考慮到濕潤劑和分散劑用量的增加將導致制劑有效成分含量的減少，在本試驗中，選擇濕潤劑與分散劑的用量為16%，此時制劑的懸浮率為82%，潤濕時間為20 s。

2.3 海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑的制備及性質測定

2.3.1 海洋多黏類芽胞桿菌菌粉的制備

結果如表10所示，自然晾干粉碎后，制備的菌粉含菌量達2.60×1011cfu/g，含水率6%，收率86.6%。自然晾干過程中芽胞死亡率低于5%，雜菌率0。

2.3.2 海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑的制備及其性質檢測

測得該制劑的潤濕時間為48 s，懸浮率為75%，含水量6%，制劑100%通過325目篩，活菌數為2.36×1011cfu/g，雜菌率為0。達到了國家對農藥可濕性粉劑的質量要求。

由表11可以看出，海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑的活菌含量隨著儲存時間的延長有所下降，但減少的速度較緩慢，保存360 d后活菌數減少較少，說明該菌株的可濕性粉劑穩定性較好。

2.4 海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑菌劑不同處理方法防治甜瓜枯萎病的田間效果

田間藥效試驗結果如表12所示（最后一次施藥后每隔10 d調查一次），不同處理方法對枯萎病的防治效果不同，綜合應用拌種、拌土、灌根的防治效果最好，拌土+灌根的防治效果次之，防效分別為84.9%和79.2%。前者的防效高于CK1（3%多抗霉素）。

3 討論

可濕性粉劑作為微生物制劑的主要劑型，相比于液體制劑更容易運輸和貯存，與其他固體制劑相比，有效成分、濕潤性等多方面都有提高，防病范圍更廣?？蓾裥苑蹌┬阅茉u價常用指標包括有效成分、懸浮率、潤濕性、含水量和細度等，其中懸浮率[19]是最重要的性能指標，其次為潤濕性和有效成分。載體雖然是一種惰性材料，但不同種類的載體對活體微生物的影響較大。王劍等[20]、賀振寧等[21]研究發現硅藻土作為生防菌的載體時，生物相容性較好，不會影響活菌生長。本研究顯示皂土與海洋多黏類芽胞桿菌有較好的生物相容性，但硅藻土會抑制其菌落的生長。因此可見，同一種載體，對不同微生物會產生不一樣的效果，所以研制不同微生物可濕性粉劑時，必須針對其所用菌株而選擇相關載體和助劑，提高其生防效果。載體和助劑的選擇對可濕性粉劑的懸浮率、濕潤時間和有效成分均有影響。劉盼西等[22]通過助劑的篩選和混料設計的試驗方法優化了海洋芽胞桿菌B-9987可濕性粉劑的制劑配方，其懸浮率為73.13%，潤濕時間100 s。由華東理工大學與上海澤元海洋生物技術有限公司聯合創制的多黏類芽孢桿菌可濕性粉劑產品的懸浮率為76.10%，潤濕時間為95 s，活菌含量為5×1010cfu/g[11]。本研究制得的海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑的懸浮率為75%，潤濕時間為48 s，活菌數為2.36×1011cfu/g，懸浮率與上述文獻報道比較接近，而潤濕時間則減少了一半，可能與可濕性粉劑中所選用的載體和助劑有關;本研究制得的可濕性粉劑是通過大罐發酵干燥濃縮得到，其含菌量遠高于同類產品。

本文研制的海洋多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑，對甜瓜枯萎病的田間綜合防效高達84.9%，高于3%多抗霉素。使用該菌劑后，甜瓜產量增加，顯示該菌株具有良好的應用前景，本研究為該菌株可濕性粉劑的工業生產奠定了基礎。

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（責任編輯：田 喆）

收稿日期： 20190402?? 修訂日期： 20190504

基金項目：連云港市科技計劃項目（現代農業）（NYYQ1619）

致? 謝： 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學，特此一并致謝。

通信作者?E-mail：baozenghai@sohu.com

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