海南橡膠樹棒孢霉落葉病菌毒素蛋白基因檢測與致病性分析

曲建楠 陳迪 侯巨梅 劉震 崔佳 劉銅 左豫虎

收稿日期： 20190306?? 修訂日期： 20190423

基金項目：海南大學(xué)高層次人才引進科研啟動基金（KYQD（ZR）1732）;海南省自然科學(xué)基金（319MS015）

致? 謝： 感謝海南大學(xué)林春花老師對本試驗技術(shù)上的指導(dǎo)！

通信作者 E-mail：劉銅liutongamy@sina.com; 左豫虎zuoyhu@163.com

# 為并列第一作者

摘要 Cassiicolin毒素蛋白是橡膠樹棒孢霉落葉病菌的主要致病因子。本研究對分離自海南省5個市縣的橡膠樹棒孢霉落葉病菌進行了鑒定，形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，病原菌為多主棒孢。利用Cassiicolin毒素不同亞型編碼基因特異性引物和菌餅活體接種法分別鑒定了分離菌株的毒素蛋白類型和致病性，結(jié)果顯示，分離的35個菌株都含有Cas5基因，未發(fā)現(xiàn)含其他類型的毒素基因，表明海南橡膠樹棒孢霉落葉病菌為含Cas5毒素蛋白優(yōu)勢群體;所有菌株對橡膠樹品種‘RRIM600都能夠致病，但是在不同抗性品種上致病性存在一定差異。

關(guān)鍵詞 橡膠棒孢霉落葉病; 多主棒孢; 毒素; 致病性

中圖分類號： S 435.76

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019110

Isolation， identification of the cassiicolin and pathogenicity analysis of Corynespora leaf fall disease of Hevea brasiliensis in Hainan

QU Jiannan1， CHEN Di2， HOU Jumei2， LIU Zhen2， CUI Jia1， LIU Tong2， ZUO Yuhu1

（1. College of Agronomy， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China;

2. Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228， China）

Abstract

Cassiicolin is the main pathogenic factor of Corynespora cassiicola. In this study， pathogens were isolated from Hevea brasiliensis samples infected with Corynespora leaf fall disease collected from five cities and counties of Hainan province， and were identified as C.cassiicola by morphological and molecular methods. The cassiicolin subtypes and pathogenicity of isolates were analyzed by using specific primers of cassiicolin and inoculation with fungus cake in vivo. The results showed that 35 isolates of C.cassiicola contained Cas5 protein， and no other types of proteins were found. It indicated that Cas5 was the dominant population in Hainan. All isolates of C.cassiicola were found to be pathogenic in ‘RRIM600 rubber species， but they also showed different pathogenicity in different rubber varieties with resistance to C.cassiicola.

Key words

Corynespora leaf fall disease; Corynespora cassiicola; cassiicolin; pathogenic

橡膠樹Hevea brasiliensis屬于大戟科三葉橡膠屬，其產(chǎn)物天然橡膠作為重要的工業(yè)原料，廣泛運用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、國防、交通、日常生活和醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域等方面[1]。由多主棒孢Corynespora cassiicola引起的橡膠棒孢霉落葉病是橡膠樹Hevea brasiliensis上一種重要的葉部病害，給我國橡膠生產(chǎn)帶來嚴重的危害[2]。2010年，Shimomoto等利用延伸因子（EF-1α）、微管蛋白（β-tubulin）和鈣調(diào)蛋白（Calmodulin）序列對不同地區(qū)和不同作物中分離得到的多主棒孢進行了同源性分析[3]。Barthe等研究表明，橡膠樹多主棒孢產(chǎn)生的cassiicolin毒素蛋白是該病菌的主要致病因子，并且在不同的菌株中存在不同毒素蛋白亞型[4]。Déon等根據(jù)多主棒孢中Cas基因的差異，將病原菌分為6個毒素亞型[5]。2016年劉先寶等報道中國橡膠樹多主棒孢優(yōu)勢群體為Cas5亞型，在海南發(fā)現(xiàn)存在一株含有Cas2亞型的菌株，推測是來源于其他作物[6]。Shuib等鑒定發(fā)現(xiàn)馬來西亞橡膠樹多主棒孢主要為Cas0與Cas5亞型[7]。Déon等從巴西巴伊亞無病癥橡膠樹葉片中分離到的多主棒孢中檢測到了Cas3和Cas4亞型[8]。Tran等研究發(fā)現(xiàn)Cas1亞型毒素比Cas5亞型毒素對橡膠樹葉片致病性更強[9]。近年來，海南橡膠樹棒孢霉落葉病在苗圃和幼齡樹上的危害有加重趨勢[10]，是否有新的毒素蛋白亞型出現(xiàn)和致病性分化尚未見報道。本研究擬從海南各主要植膠產(chǎn)區(qū)采集、分離橡膠樹棒孢霉落葉病菌菌株，通過毒素蛋白基因檢測和致病性分析，以期明確海南橡膠樹棒孢霉落葉病菌群體毒素類型和致病性變化情況，為科學(xué)防治海南橡膠樹棒孢落葉病提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2017年5、7月和11月，參照《橡膠樹主要病害診斷與防治原色圖譜》[11]中橡膠樹棒孢霉落葉病病斑形態(tài)特征，分別在海南省儋州市、白沙黎族自治縣、五指山市、樂東黎族自治縣和保亭黎族苗族自治縣橡膠林采集橡膠樹棒孢霉落葉病的病葉。

健康橡膠苗‘文昌11‘熱研7-33-97‘熱研7-20-95‘熱研8-79‘RRIM600，由國家橡膠樹種質(zhì)資源圃提供。

葡萄糖、瓊脂糖、無水乙醇為生工生物工程（上海）股份有限公司提供。50×TAE、PGM-T Ligation Kit為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

在海南大學(xué)海甸校區(qū)熱帶農(nóng)林學(xué)院植物病害防控實驗室采用組織分離法進行病原菌分離。選取葉片新鮮、病斑清晰的橡膠樹葉片，利用手術(shù)剪在無菌操作臺中剪取病健交界處約0.5 cm×0.5 cm病葉組織，用75%乙醇浸泡3～5 s，然后用無菌水清洗3～5次，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3～4 d，待長出菌絲后挑取到新的PDA平板上，轉(zhuǎn)接3～4次。將純化得到的病原菌進行單孢分離，轉(zhuǎn)接到PDA試管斜面，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性分析

將‘文昌11‘熱研7-33-97‘熱研7-20-95‘熱研8-79‘RRIM600移栽至海南大學(xué)海甸校區(qū)實驗基地。每個品種各50株，株高約1 m，每株8～10個分枝，21～30片葉，待移栽橡膠樹苗生長出3～5個新分枝，選取中部健康葉片，進行室外活體接種。在每個葉片葉脈左側(cè)中間處用無菌牙簽輕微刺傷并接一個菌餅，空白對照為刺傷后接種PDA培養(yǎng)基，每個品種接種9個葉片，套袋保濕培養(yǎng)。接種9 d后，記錄發(fā)病情況，試驗重復(fù)3次。根據(jù)柯赫氏法則，待葉片發(fā)病后與自然發(fā)病葉片癥狀進行比較，并重新分離病原菌，與原接種菌進行比較。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將分離純化的病原菌接種于PDA平板上，28℃培養(yǎng)，觀察7 d菌齡的菌落形態(tài)特征、顏色，并記錄其生長速度。利用涂布器將在PDA平板上生長10 d的病原菌菌絲刮去，并利用三層滅菌紗布包裹培養(yǎng)皿口，在人工氣候箱中，28℃光照培養(yǎng)3 d，然后加入適量無菌水并利用涂布器輕刮平板，利用三層紗布過濾，得到病原菌孢子懸浮液用于分生孢子形態(tài)觀察。病原菌分生孢子形態(tài)參照《真菌鑒定手冊》[12]進行比對鑒定。

1.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

為了更精確地鑒定病原菌，通過CTAB法[14]提取DNA，利用通用引物ITS、延伸因子（EF-1α）和微管蛋白基因（β-tubulin）[34]（表1）進行PCR，回收PCR產(chǎn)物，將產(chǎn)物連接到PGM-T載體，送至廣州天一輝遠公司進行測序，將測序結(jié)果在NCBI進行比對分析。

將獲得的ITS序列、延伸因子（EF-1α）序列和微管蛋白（β-tubulin）序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中18株棒孢屬菌株BS2、ST3、T1、FN3、GEV1559、NRC2-1、EH-1070、HLH-1-1、ZM160181、KMC1、CCC85、XQ3-1、FCC90、ACC42、PCC86、CGJ1、CBS 135133、CPC 31708和長喙殼菌MUCL44885、尖孢鐮刀菌R1、疫霉Ps-737、灰葡萄孢F734的ITS序列、延伸因子（EF-1α）序列和微管蛋白（β-tubulin）序列進行比較，利用MEGA 7進行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 毒素蛋白亞型鑒定

利用6種毒素亞型Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5和Cas6特異性引物[5，8]（表1）對病原菌毒素亞型鑒定，回收PCR產(chǎn)物，將產(chǎn)物連接到PGM-T載體，送至廣州天一輝遠公司進行測序，將測序結(jié)果在NCBI進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離與純化

從儋州市、白沙黎族自治縣、五指山市、保亭黎族苗族自治縣、樂東黎族自治縣橡膠林采集的病葉中分別獲得19、6、2、1和7株病原菌，共35株病原菌。根據(jù)其采集的地點及葉片的采集順序進行編號，對純化后的病原菌進行形態(tài)觀察。

2.2 致病性分析

通過致病性鑒定，35株分離菌株均能侵染‘RRIM600橡膠樹。有7、9、21、28株分離菌株分別能夠侵染‘文昌11‘熱研7-33-97‘熱研8-79‘熱研7-20-95葉片并導(dǎo)致發(fā)病（表2），有6株病原菌DZ-27、DZ-123、DZ-131、BS-35、BS-37、BS-43對供試的5個橡膠樹品種均具有侵染性，它們分別分離自儋州市與白沙黎族自治縣的橡膠樹病葉。這些結(jié)果表明海南省橡膠樹棒孢落葉病菌在不同抗性橡膠樹品種上的致病性不同，所有分離菌株對‘RRIM600都具有致病性。

室外接菌試驗表明，品種‘RRIM600葉片發(fā)病率達100%，但不同菌株引起的發(fā)病程度有差異，空白對照未發(fā)病。發(fā)病橡膠樹葉片病斑呈魚骨狀，與自然條件下橡膠樹棒孢霉落葉病病斑相同。在接菌保濕培養(yǎng)的第9天，采集發(fā)病的橡膠樹葉片，對其病菌進行再分離，35株病原菌均與供試菌株菌落形態(tài)相同，病菌回收率為100%，確定其為橡膠樹棒孢霉落葉病的致病菌。

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

參照《橡膠樹主要病害診斷與防治原色圖譜》[12]中菌落生長及形態(tài)特征，對病原菌進行初篩，發(fā)現(xiàn)35株病原菌均疑似為多主棒孢。利用PDA培養(yǎng)基對35株病原菌進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)所有菌株第3天均產(chǎn)生大量氣生菌絲，菌絲叢生，呈絨毛狀;隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，基生菌絲逐漸變成褐色或黑色，氣生菌絲呈灰色或白色絨毛狀，菌落邊緣呈灰色或白色菌圈，部分菌落產(chǎn)生紅褐色色素（表3）。對35株病原菌進行孢子形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)35株病原菌孢子均為頂生，單生，呈倒棍棒狀，直立或略彎曲，大小為（30～60）μm×（3～10）μm，有3～16個隔（圖1）。與《真菌鑒定手冊》[13]描述的橡膠樹多主棒孢菌的形態(tài)相似，可初步鑒定為多主棒孢。

2.4 病原菌分子鑒定

分別利用ITS、延伸因子（EF-1α）和微管蛋白（β-tubulin）通用引物對35株病原菌進行PCR檢測，均得到單一條帶。將測序結(jié)果通過NCBI比對，發(fā)現(xiàn)所有菌株與所報道的多主棒孢具有99%以上同源性。進一步將35株病原菌與18株已鑒定的棒孢屬菌株、蛇口目桿菌Ophiostoma bacillisporum、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、疫霉菌Phytophthora niederhauserii和灰葡萄孢Botrytis cinerea的rDNA-ITS，EF-1α，β-tubulin進行遺傳進化分析，35株菌株與已知的棒孢屬多主棒孢聚集

在一起，表明分離獲得的35株病原菌為多主棒孢C.cassiicola（圖2）。

2.5 毒素蛋白亞型的檢測

利用特異性毒素亞型鑒定引物Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6對35株病原菌進行檢測，僅有Cas5引物能擴增出一條電泳條帶。通過測序和NCBI對比，結(jié)果顯示35株病原菌均攜帶Cas5基因，即35株多主棒孢均屬于Cas5亞型（圖3），表明海南橡膠樹棒孢霉落葉病菌為含Cas5毒素蛋白優(yōu)勢群體。

3 討論

Déon在2014年利用ITS對來自不同作物的128株多主棒孢進行了同源性分析，研究結(jié)果顯示128株多主棒孢可分為7個分支，其中含相同毒素基因的多主棒孢分別聚類到同一分支，表明含不同毒素亞型的菌株存在遺傳上的分化[6]。本研究同時利用ITS、延伸因子（EF-1α）和微管蛋白（β-tubulin）對橡膠樹上分離得到的病原菌進行遺傳進化關(guān)系分析，35株病原菌都聚集在同一分支，尚未發(fā)現(xiàn)海南省橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌存在遺傳分化。

劉先寶等在6個省的5個物種中進行多主棒孢的分離鑒定與毒素蛋白亞型檢測，在海南省橡膠樹中分離得到14株多主棒孢，其中13株中檢測到Cas5毒素蛋白，1株中檢測到Cas2毒素蛋白，推測含Cas2基因的菌株可能來自于其他作物，并非來自橡膠樹[7]。本研究于2017年5、7月和11月，在海南省橡膠主產(chǎn)區(qū)橡膠樹中分離得到35株多主棒孢，橡膠樹棒孢霉落葉病菌素毒蛋白亞型檢測結(jié)果表明所有供試菌株只含有Cas5，均未檢測出其他毒素蛋白。因此可以明確海南橡膠樹棒孢落葉病菌的毒素蛋白為Cas5亞型。

通過對35株多主棒孢進行致病性檢測，得到6株強致病性菌株，分別來自海南省北部的儋州市與白沙黎族自治縣，而在海南省中部及南部的保亭黎族苗族自治縣、五指山市和樂東黎族自治縣分離得到的多主棒孢致病性較弱，推測海南省多主棒孢的致病性可能與地理位置有關(guān)。35株多主棒孢對不同橡膠樹品種的致病性有較大差異，采用抗病品種可以有效防治該病。另外，對所有供試分離菌株在同一橡膠樹品種做致病性檢測時，發(fā)現(xiàn)其致病性也存在明顯的差異。因此推測該病原菌除了Cas5毒素蛋白為重要致病因子外，可能還存在其他的致病因子。

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（責任編輯：田 喆）