云南核桃葉枯病病原鑒定及其生物學(xué)特性

樊炳君 趙玉美 陳俊珠 趙寧 楊斌 陳玉惠

摘要 為明確引起云南核桃葉枯病的病原及其生物學(xué)特性，本文對分離自葉枯病病斑上的一株擬盤多毛孢進行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并通過柯赫氏法則驗證其致病性;采用生長速率法、懸滴法和載玻片法研究其菌絲生長和孢子萌發(fā)的生物學(xué)特性。結(jié)果表明，該菌株為小孢擬盤多毛孢Pestalotiopsis microspora，是引起云南核桃葉枯病的新病原。該病原菌的最適生長溫度為20～25℃，最適光周期L∥D=12 h∥12 h，最適生長pH為4～8。病原菌的分生孢子萌發(fā)受pH和濕度的影響較大，在中性及堿性環(huán)境下不萌發(fā)，最適萌發(fā)pH為4～5;在高于90%的相對濕度下才能萌發(fā)。分生孢子在20～25℃下萌發(fā)率最高，全光照最適于孢子萌發(fā);核桃葉汁液對分生孢子萌發(fā)有顯著的促進作用。

關(guān)鍵詞 核桃葉枯病; 小孢擬盤多毛孢; 菌株鑒定; 生物學(xué)特性

中圖分類號： S 436.65

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019076

Identification and biological characteristics of a new pathogen causing the walnut leaf blight in Yunnan province

FAN Bingjun， ZHAO Yumei， CHEN Junzhu， ZHAO Ning， YANG Bin， CHEN Yuhui

（Southwest Forestry University， Kunming 650224， China）

Abstract

In the present study， the identification and biological characteristics of the pathogen causing the walnut leaf blight in Yunnan province were studied. The pathogenicity test was done based on the Kochs postulates; the pathogen was identified based on morphological characteristics and molecular evidence， and the biological characteristics were determined by using the methods including colony growth and spore germination. The results showed that the strain was identified as Pestalotiopsis microspora as the new pathogen of walnut leaf blight. The growth of P.microspora was best at 20-25℃， pH 4-8 on PDA medium， and the optimal light conditions were alternation of 12 h light and 12 h dark. The conidia were harder to germinate below 90% relative humidity or above pH 6. The conidia were best to germinate at 20-25℃; the optimum light conditions were full light， and the optimum pH values were 4-5. The walnut leaf juice had a remarkable promotion function to mycelium growth.

Key words

walnut leaf blight; Pestalotiopsis microspora; identification; biological characteristics

胡桃Juglans L.，又名核桃，隸屬于殼斗目Fagales胡桃科Juglandaceae的落葉喬木[1]，是我國重要的經(jīng)濟林樹種，其果實營養(yǎng)豐富，且具有很好的保健作用，被譽為“21世紀(jì)的超級食品”。在我國，核桃主要分布在云南、四川、山西、陜西等地。核桃因其較高的經(jīng)濟價值，近年來在我國的栽培面積正以每年10%的速度遞增，并已成為許多山區(qū)農(nóng)民增收致富的支柱產(chǎn)業(yè)。據(jù)云南省林業(yè)廳統(tǒng)計，截至2017年底，云南核桃種植面積達(dá)288.1萬hm2，年產(chǎn)量300萬t，產(chǎn)值185億元，均居全國首位[2]，核桃產(chǎn)業(yè)在云南省的經(jīng)濟發(fā)展中起著不可或缺的作用。然而，隨著核桃種植面積的擴大、品種單一種植及管理粗放等，目前已導(dǎo)致許多核桃種植區(qū)病害頻發(fā)且有逐年加重之勢，嚴(yán)重影響核桃的正常生長和結(jié)實，使核桃產(chǎn)量降低，給種植地區(qū)造成較大的經(jīng)濟損失。

目前國內(nèi)外關(guān)于核桃病害的研究主要集中在引起核桃炭疽病、黑斑病、枝枯病、潰瘍病等病害病原菌的鑒定、危害、防治等方面[36]。其中葉部病害研究較多的有白粉病Microspharea yamadai、炭疽病Gloeosporium fructigenum、褐斑病Marssonina juglandis、灰斑病Phyllosticta juglandis、葉斑病Alternaria alternata[7]等，未見對由擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis真菌引起的核桃葉枯病的報道。本研究組在對云南省核桃主產(chǎn)區(qū)核桃病害調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，部分地區(qū)的核桃發(fā)生嚴(yán)重的葉枯病，表現(xiàn)為整株葉片邊緣枯黃并逐漸向內(nèi)擴展，最終全葉枯死，明顯影響植株的正常生長和核桃產(chǎn)量。通過對病組織的切片觀察，該病害由擬盤多毛孢屬真菌引起，為明確其病原菌種類及生物學(xué)特性，本研究采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)手段對分離自病組織上的1株擬盤多毛孢（QZLL2菌株）進行了鑒定，同時通過接種驗證其致病性，并對其菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的生物學(xué)特性進行了研究。為該病的發(fā)病規(guī)律研究、預(yù)測預(yù)報及防治等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬盤多毛孢QZLL2菌株，由“云南核桃主要病蟲害種類及危害評價”項目組提供，保藏于西南林業(yè)大學(xué)生物化學(xué)教研室;一年生泡核桃Juglans sigillata Dode實生苗由云南省楚雄市大姚縣金碧鎮(zhèn)花卉公司提供。

1.2 菌株培養(yǎng)

從保藏試管中挑取供試菌株接種在PDA平板上，于25℃±2℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。

1.3 菌株鑒定

從已培養(yǎng)好的菌落邊緣挑取少量菌絲接種在PDA平板中央培養(yǎng)，每隔1 d觀察1次并記錄菌落生長狀況和形態(tài)特征，待菌落產(chǎn)孢后挑取少許子實體及孢子制備水浮載玻片，置于顯微鏡下觀察其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)并測量孢子大小[8]，然后查閱相關(guān)資料[911]進行形態(tài)學(xué)鑒定。

同時，將培養(yǎng)好的菌株送昆明碩擎生物科技有限公司進行基因組提取，并以ITS1/ITS4和BT-2A/BT-2B為引物進行PCR擴增和測序。獲取ITS和β-微管蛋白基因序列后，在GenBank中采用BLAST軟件對測序結(jié)果進行同源性比對，并選擇合適的序列，通過Mafft軟件進行比對，運用BioEdit軟件對序列進行剪切，選擇擬盤多毛孢近緣屬五隔盤單毛孢Seiridium cardinale（AF40995，AF377298;AF320503）為外群，采用Paup軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉法（bootstrap）檢驗的重復(fù)數(shù)為1 000次。

1.4 菌株的致病性測定

1.4.1 接種

室外活體植株接種：從已大量產(chǎn)孢的菌落上挑取少許孢子，用無菌水制備成濃度為9.5×106個/mL的孢子懸浮液。在長勢、大小基本一致的3株健康核桃幼樹上選取位置相似的嫩葉各3片，經(jīng)75%乙醇表面消毒后，用石英砂摩擦制造傷口，將孢子懸浮液涂抹在處理后的葉片上并套袋保濕，2 d后取袋，定期觀察葉片發(fā)病狀況，以涂抹無菌水的葉片為對照。

室內(nèi)離體接種：取長勢、大小相似且健康的6片核桃新鮮幼葉，采用與室外接種相同的方法進行接種，然后將接種好的葉片放入鋪有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25℃±2℃、L∥D=12 h∥12 h的培養(yǎng)室培養(yǎng)，接種2 d后觀察記錄葉片發(fā)病狀況。

1.4.2 菌株的再分離鑒定

采用組織分離法[12]從接種后發(fā)病葉的病組織上再分離供試病原菌，獲得純菌株后按1.3的方法再進行分離菌株的鑒定。

1.5 菌株的生物學(xué)特性研究

1.5.1 菌絲生長的生物學(xué)特性

采用生長速率法[12]測定供試菌株菌絲生長的生物學(xué)特性。具體方法為：選擇同一生長時期的菌落在無菌條件下用滅菌打孔器沿菌落邊緣打取大小相同的菌塊，置于PDA平板中央，在所設(shè)置的各條件（5、10、15、20、25、30、35、40℃ 8個溫度梯度;全光照、L∥D=12 h∥12 h、全黑暗3個光照條件;pH 2～11等10個不同pH梯度）下進行培養(yǎng)，每處理設(shè)3個重復(fù)。除不同溫度處理外，其余處理均在25℃±2℃下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，每隔2 d按十字交叉法測量菌落直徑，同時觀察產(chǎn)孢情況。

1.5.2 孢子萌發(fā)的生物學(xué)特性

1.5.2.1 溫度、光照對孢子萌發(fā)的影響

采用載玻片法研究溫度、光照對供試菌株分生孢子萌發(fā)的影響。具體方法為：在滅菌的載玻片上倒入水瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，用滅菌涂布棒蘸取濃度為9.5×106個/mL的孢子懸浮液，均勻地涂于水瓊脂板上，然后將載玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于所設(shè)各溫度（5、10、15、20、25、30、35、40℃）和光照條件（全光照、L∥D=12 h∥12 h、全黑暗）下進行培養(yǎng)，溫度試驗在冰箱（5℃、10℃）和恒溫培養(yǎng)箱中進行，光照試驗在光照培養(yǎng)箱中于25℃±2℃下進行，8 h后鏡檢計數(shù)孢子萌發(fā)情況。

1.5.2.2 pH對孢子萌發(fā)的影響

采用懸滴法研究pH對供試菌株分生孢子萌發(fā)的影響。具體方法為：在滅菌凹片中分別加入pH為2、3、4、5、6、7、8、9的水溶液30 μL，再分別各加入10 μL的孢子懸浮液，然后將凹片置于25℃±2℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 h后鏡檢計數(shù)孢子萌發(fā)情況。

1.5.2.3 濕度對孢子萌發(fā)的影響

采用小容器空氣濕度法[12]設(shè)置70%、80%、90%、100%、100%+水，5個不同相對濕度條件。然后按1.5.2.1的方法制備水瓊脂板并分別將其放在上述不同濕度條件下，在25℃±2℃下培養(yǎng)并于8 h后鏡檢計數(shù)孢子萌發(fā)情況。

1.5.2.4 核桃葉汁液對孢子萌發(fā)的影響

參照陳長卿等[13]的方法研究寄主汁液對孢子萌發(fā)的影響。10%核桃葉汁液的制備：采集長勢、大小相似且健康的泡核桃葉片，剪碎稱重后均分為兩份。一份放入燒杯加蒸餾水煮沸2 min;另一份放入研缽加入適量蒸餾水研磨2 min。然后分別在5 000 r/min下離心5 min，取上層液體重復(fù)離心兩次，合并上清液并用蒸餾水將其稀釋成10%的核桃葉汁液。

取制備好的兩種核桃葉汁液分別替代蒸餾水制備水瓊脂板。然后按1.5.2.1中的方法在25℃±2℃下完成兩種核桃葉汁液對孢子萌發(fā)影響的試驗。

1.6 結(jié)果觀察及數(shù)據(jù)分析

孢子萌發(fā)試驗中，每個項目設(shè)置3個重復(fù)，每種試驗條件下鏡檢的孢子數(shù)不少于200個。觀察至萌發(fā)率達(dá)到90%以上停止，以芽管長度超過孢子直徑的1/2為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。

孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)孢子總數(shù)×100%。

各試驗項目所獲數(shù)據(jù)通過SPSS Statistics軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的致病性

核桃葉枯病在野外的典型癥狀為：發(fā)病初期，葉片上出現(xiàn)圓形或近圓形水漬狀深褐色小病斑（主要分布在葉中脈外靠近葉緣處），后逐漸向周圍擴展成近圓形、橢圓形或不規(guī)則的病斑，同時病斑中部顏色變

淺呈灰色，邊緣深褐色，病健交界區(qū)分明顯。隨著病

害的繼續(xù)發(fā)展，葉緣處病斑相互連接成片;病害后期，受害葉緣所有病斑聯(lián)合成片，病斑顏色繼續(xù)變淺呈黃白色，邊緣褐色，病斑上出現(xiàn)明顯或不明顯的輪紋，葉片干枯卷曲，脫落（圖1a）。采用QZLL2菌株進行的人工接種試驗結(jié)果顯示，室內(nèi)外接種后的核桃葉會出現(xiàn)相似的病害癥狀。室外活體接種8 d后，接種葉片出現(xiàn)近圓形或橢圓形的深褐色水漬狀病斑，接種16 d后，病斑向內(nèi)擴展，中央顏色變淺，呈灰白色，邊緣深褐色，有明顯輪紋出現(xiàn)（圖1b-1）;室內(nèi)離體接種4 d后，接種葉邊緣出現(xiàn)零星的黑色小點，8 d后出現(xiàn)不規(guī)則連片黑褐色病斑，其上可見有絨毛狀白色菌絲生長（圖1c-1）;接種16 d后，接種葉的大部分已變黑，有的甚至全葉變黑死亡。而對照均未出現(xiàn)異常癥狀（圖1b-2和c-2）。

從接種葉片病組織上再分離獲得的菌株QZLL3菌落及分生孢子的形態(tài)、顏色等均與原菌株（圖2、圖3）相似，表明QZLL2菌株為核桃葉枯病的病原菌。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定

QZLL2菌株在PDA上（25±2）℃黑暗條件下培養(yǎng)8 d后菌落直徑達(dá)8.50 cm，白色絨毛狀，質(zhì)地較密;菌落背面淡黃色，具不明顯圓形輪紋（圖2）;培養(yǎng)14 d后，菌落上產(chǎn)生黑色分生孢子堆。分生孢子長梭形或細(xì)紡錘形，直或稍彎曲，具4個隔膜，分隔處稍縊縮，頂端具2～4根附屬絲，長4.5～25.0 μm，基部1根附屬絲，長2.75～7.75 μm。分生孢子由5個細(xì)胞組成，兩端細(xì)胞無色，中間3個細(xì)胞暗褐色至淺褐色。分生孢子長20.0～27.0 μm、寬5.5～6.5 μm，長寬比為3.64～4.15，3色胞長13.0～18.5 μm（圖3）。

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀，該菌株與小孢擬盤多毛孢Pestalotiopsis microspora的形態(tài)相似[910，1415]。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

原菌株QZLL2和接種后發(fā)病組織上再分離菌株QZLL3經(jīng)ITS和β-tubulin基因測序，分別得到大小為576 bp和581 bp的2條rDNA-ITS序列片段和2條序列一致（455 bp）的β-tubulin基因序列片段，將其提交GenBank（ITS序列登錄號分別為MK064588和MK064589，β-tubulin基因序列登錄號MK478772）并與相關(guān)核酸序列進行同源性比對，它們的ITS序列與Pestalotiopsis microspora（KT366172、KT372347）的同源性達(dá)到100%，在系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）上同屬一個分支，而它們的β-tubulin基因序列與P.microspora（KU377338）的同源性也達(dá)到100%（圖5），表明QZLL2和QZLL3兩個菌株與小孢擬盤多毛孢P.microspora的親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)和分子生物學(xué)分析，QZLL2和QZLL3菌株都為小孢擬盤多毛孢。

2.3 菌絲生長的生物學(xué)特性

2.3.1 溫度對菌絲生長的影響

QZLL2菌株在5～30℃范圍內(nèi)均能生長，在低于15℃下生長速度明顯下降，高于30℃條件下菌絲完全不能生長。菌絲在20～25℃下生長旺盛，生長速度最快，也最易產(chǎn)孢，8 d時其菌落直徑與其他溫度下生長的菌落直徑間均存在顯著差異（表1）。

2.3.2 光照對菌絲生長的影響

半光照和全黑暗條件下供試菌株的生長無明顯差異，兩種條件都有利于菌絲的生長和產(chǎn)孢，而連續(xù)光照則不利于該菌株菌絲的生長，菌落生長慢且菌絲稀薄，菌落直徑與半光照和黑暗下的菌落直徑間存在顯著差異（表2）。

2.3.3 pH對菌絲生長的影響

QZLL2菌株菌絲生長的pH范圍廣泛，在pH 3～11的環(huán)境下均能生長，但在pH 4～8下生長最好，生長4、6、8 d時彼此間沒有顯著差異。在pH 9的環(huán)境下菌絲生長速度較快，但菌落生長相對較差，在pH高于10和低于3時菌絲生長都會受到一定抑制。培養(yǎng)10 d后，該菌株僅在pH 5和6的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢（表3）。

2.4 分生孢子萌發(fā)的生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響

供試菌株的分生孢子在10～35℃條件下均可萌發(fā)（圖6）。在20～30℃范圍內(nèi)萌發(fā)速度最快，25℃下的萌發(fā)率最高，8 h的萌發(fā)率達(dá)到20.50%，24 h時達(dá)到91.48%;在10℃和35℃下，孢子的萌發(fā)速度和萌發(fā)率都受到一定抑制。

2.4.2 光照對分生孢子萌發(fā)的影響

供試菌株的分生孢子在不同光照下都能萌發(fā)，處理24 h后孢子萌發(fā)率均超過了60%。其中，全光照最有利于分生孢子的萌發(fā)，培養(yǎng)16 h時萌發(fā)率已超過90%，其次為半光照。全黑暗下萌發(fā)率相對較低，但24 h后其萌發(fā)率仍能達(dá)到60%以上（圖7）。

2.4.3 pH對分生孢子萌發(fā)的影響

不同pH條件下QZLL2菌株分生孢子的萌發(fā)率見圖8。圖8顯示，分生孢子在偏酸性條件下都能萌發(fā)，而在中性和偏堿性條件下不萌發(fā)。其中在pH 為4和5的條件下分生孢子萌發(fā)率較高，培養(yǎng)24 h的萌發(fā)率分別達(dá)到86.21%和78.26%，而在pH 為6條件下，培養(yǎng)8 h和16 h的萌發(fā)率都較低，分別僅為1%和7.62%，但在培養(yǎng)至24 h時，萌發(fā)率可達(dá)到70.15%。

2.4.4 相對濕度對孢子萌發(fā)的影響

環(huán)境相對濕度對供試菌株分生孢子萌發(fā)的影響較大，孢子在相對濕度90%以上才能萌發(fā)，且濕度越大萌發(fā)率越高。在100%+水的相對濕度條件下分生孢子萌發(fā)最好，處理16 h時萌發(fā)率已超過60%，24 h時達(dá)到86.87%（圖9）。

2.4.5 寄主葉片汁液對孢子萌發(fā)的影響

圖10顯示，新鮮和加熱處理后的核桃葉汁液對供試菌株分生孢子萌發(fā)的影響無顯著差異。同對照相比，兩者對孢子的萌發(fā)都具有明顯的促進作用，尤其在早期最為明顯，8 h時孢子的萌發(fā)率便均已超過90%，分別達(dá)到91.87%和93.60%，而對照僅為18.81%。

3 討論

擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis是一類常見的植物病原菌，主要危害植物的葉、枝和果實，引起枝枯、葉斑和果實黑斑病等，嚴(yán)重影響受害植物的生長發(fā)育及經(jīng)濟價值[1618]。擬盤多毛孢屬真菌作為病原菌，有些種的寄主范圍較為廣泛，同一個種可侵染多種植物或同種植物的不同部位，產(chǎn)生相同或不同的病害癥狀[1920]。目前國內(nèi)已報道的寄主植物以經(jīng)濟林木和園林樹木為主，病原菌種類有小孢擬盤多毛孢、韋斯梅擬盤多毛孢Pestalotiopsis vismiae、棒狀擬盤多毛孢P.clavispora等，其中以小孢擬盤多毛孢引起的病害最多，包括了葉部病害[21]、枝干病害[10]和果實病害[22]等。據(jù)前人報道，由小孢擬盤多毛孢引起的葉部病害雖然在不同受害植物上的危害癥狀有所不同，但一般都表現(xiàn)為受害葉初期多出現(xiàn)淺褐色或褐色圓形或不規(guī)則小斑點，后逐漸形成中央黃褐色或灰白色，邊緣黑褐色的橢圓形、圓形或不規(guī)則病斑，后期病斑連接成片，有的后期病斑上可見明顯或不明顯的輪紋，最終葉片枯死脫落或不脫落[1415，2325]。本研究中所報道的QZLL2菌株在云南核桃葉上所致病害癥狀與上述報道的葉部病害癥狀基本一致。

關(guān)于核桃葉枯病的研究，徐陽等[26]曾報道了一種在和田地區(qū)由鏈格孢菌Alternaria alternata引起的核桃葉枯病，但該病害的癥狀與本研究中的葉枯病病害癥狀有所不同。而對于由小孢擬盤多毛孢引起的核桃葉枯病，至今尚未見國內(nèi)外有相關(guān)報道。馬建鵬等[27]曾報道擬盤多毛孢危害云南核桃的葉、花、枝和果并對其進行了防治研究，但至今未見有關(guān)病原菌種的鑒定報道。而國內(nèi)有學(xué)者證實，小孢擬盤多毛孢可危害與核桃同屬胡桃科Juglandaceae的山核桃屬Carya浙江山核桃C.cathayensis的果實引起黑斑病，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[6]。本研究中的病原菌小孢擬盤多毛孢是否也能危害云南核桃的花、枝和果值得做進一步的驗證。

本研究對引起云南核桃葉枯病的小孢擬盤多毛孢QZLL2菌株的菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的生物學(xué)特性進行了研究。結(jié)果表明，該菌株的菌絲生長對環(huán)境的要求相對較低，與引起其他植物病害的同種病原小孢擬盤多毛孢菌絲生長的生物學(xué)特性相似[28]。而作為侵染源的分生孢子在10～35℃、pH 4～6和3種不同的光照條件下都能很好地萌發(fā)，但相對濕度必須達(dá)到90%及以上時孢子才能萌發(fā)。因此，林間濕度是該病害流行的主要影響因子。

本研究在完成柯赫氏法則驗證試驗時，由于室外環(huán)境較為復(fù)雜，溫度、光照、濕度及其他生物等外界因素難以控制，導(dǎo)致室外活體接種成功率較低。而室內(nèi)接種則因條件易于控制，接種成功率較高。但由于室內(nèi)為離體接種且接種葉較為幼嫩，因此，所表現(xiàn)出的癥狀與自然發(fā)病葉和室外活體接種葉所表現(xiàn)出的癥狀存在一定差異。此外，本研究僅對小孢擬盤多毛孢單獨侵染核桃葉部時的發(fā)病情況進行研究，該病原菌是否會與其他病原共同侵染核桃葉還有待后續(xù)研究。

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（責(zé)任編輯：田 喆）

收稿日期： 20190224?? 修訂日期： 20190322

基金項目：?云南省林業(yè)科技創(chuàng)新項目（2014cX05）;云南省教育廳項目（2016YJS101）

致? 謝： 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

通信作者?E-mail：cyh196107@126.com

#?為并列第一作者