草莓應(yīng)答炭疽菌侵染的轉(zhuǎn)錄組分析

陳哲 黃靜 趙佳 梁宏

摘要 本研究以栽培草莓為材料，用炭疽菌對(duì)植株進(jìn)行侵染，對(duì)健康草莓和患病草莓進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-seq），共得到86 988個(gè)序列以及2 127個(gè)差異表達(dá)基因。利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要聚類在光合作用、氧化還原過(guò)程、氧化還原酶活性、碳固定過(guò)程以及糖代謝過(guò)程等方面。同時(shí)，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因影響的通路進(jìn)行注釋后發(fā)現(xiàn)，炭疽菌侵染主要影響了光合作用、倍半萜和三萜生物途徑、類黃酮生物合成、谷胱甘肽代謝和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。挑選了20個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR，結(jié)果有19個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄測(cè)序結(jié)果一致。本研究獲得的草莓應(yīng)答炭疽菌侵染轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，將有助于豐富草莓抗炭疽病的調(diào)控機(jī)制。

關(guān)鍵詞 草莓; 炭疽菌; 轉(zhuǎn)錄組分析; 差異表達(dá)基因

中圖分類號(hào)： S 436.63

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019096

Transcriptomics analysis of strawberry response to

Colletotrichum theobromicola infection

CHEN Zhe， HUANG Jing， ZHAO Jia， LIANG Hong

（Biotechnology Research Center， Shanxi Academy of Agriculture Sciences， Taiyuan 030031， China）

Abstract

In this study， we analyzed the response of strawberry plants（Fragaria×ananassa） to infection with Colletotrichum theobromicola using the next-generation sequencing （RNA-seq） and investigated the alterations in gene expression between the healthy and infected plants. We have identified 86 988 unigenes， of which 2 127 were differentially expressed in the fungi-infected plants （DEGs）. The unigenes were annotated and classified with Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） analyses. The DEGs annotated to the GO database were distributed in many functional types， including photosynthesis， oxidation-reduction process， oxidoreductase activity and growth， development and metabolism. The KEGG pathway analysis of these genes suggested that strawberry disease caused by C.theobromicola may affect multiple processes including photosynthesis， sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis， flavonoid biosynthesis， glutathione metabolism and plant hormone signal transduction. In order to validate our DGE data， 20 DEGs with annotations were selected for qRT-PCR analysis. Among them，19 out of 20 DGEs exhibited a consistent expression pattern between RNA-Seq and qRT-PCR.The comprehensive transcriptome information obtained in this study will help to understand the regulatory mechanisms involved in strawberry response to C.theobromicola infection.

Key words

strawberry; Colletotrichum theobromicola; transcriptomics analysis; differentially expressed genes

炭疽病的病原菌為炭疽菌屬Colletotrichum的多種真菌[1]，其中可以侵染草莓的病原菌多是C.acutatum復(fù)合種[2]（C.nymphaeae、C.cuscutae、C.godetiae、C.salicis和C.simmondsii）和C.gloeosporioides復(fù)合種[3]（C.fructicola和C.theobromicola）。炭疽病可在草莓、蘋果、梨、棗、柑橘和虎耳草等多種植物中發(fā)生，給這些植物的生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。近年來(lái)，炭疽病在草莓生產(chǎn)中發(fā)生日趨嚴(yán)重，已經(jīng)成為草莓苗期甚至整個(gè)生長(zhǎng)期的主要病害，是設(shè)施草莓移栽后成活率低的主要原因之一，給草莓生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重影響。目前， 生產(chǎn)上針對(duì)炭疽病的防治主要有化學(xué)防治及一些微生物防治的方法，前者易造成藥物殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題，后者則往往以預(yù)防為主。種植抗性品種是防治草莓炭疽病最根本的方法，這樣才能從源頭上解決炭疽病侵染[4]。

植物在逆境脅迫下，轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)會(huì)發(fā)生很大的改變。近年來(lái)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）發(fā)展成為研究逆境應(yīng)答、挖掘新基因及代謝途徑確定的重要技術(shù)之一[5]。張明偉等研究發(fā)現(xiàn)野生稻基因?qū)胂礧6023在受到白葉枯菌侵染后，差異表達(dá)基因主要富集在次生代謝產(chǎn)物的生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及糖代謝途徑等方面，并從中挖掘出了多個(gè)抗病基因[6]。劉之慧等發(fā)現(xiàn)，不同配比的紅藍(lán)光對(duì)草莓組培苗有機(jī)物的積累與代謝、光合作用、葉綠素的產(chǎn)生與代謝、植物激素的產(chǎn)生均有明顯作用[7]。張小芳等發(fā)現(xiàn)耐旱型野生大豆受到干旱脅迫后，其差異表達(dá)基因廣泛涉及糖、脂類、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子代謝、能量代謝以及次生代謝過(guò)程，代謝途徑則涉及植物-病原體互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA降解和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[8]。

本研究用膠孢炭疽菌侵染草莓根部，待草莓發(fā)病后，對(duì)健康草莓和患病草莓進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，找到二者在轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)的差異，分析參與植物抗病過(guò)程的相關(guān)基因和途徑，為草莓抗病品種的選育提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試草莓和炭疽菌菌株供試草莓品種為‘紅顏。

供試真菌草莓炭疽菌C.theobromicola TAN-9為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院張國(guó)珍老師贈(zèng)送。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

1.3 病原菌侵染試驗(yàn)

將健康、生長(zhǎng)狀態(tài)一致的2葉1心草莓幼苗移植到滅菌基質(zhì)中，處理組（D）和對(duì)照組（CK）各15株。待移苗成功10 d后對(duì)處理組草莓進(jìn)行傷根處理，并澆灌濃度為1×106 個(gè)/mL草莓炭疽菌TAN-9的孢子懸浮液;對(duì)照組澆灌無(wú)菌水。此后，結(jié)合草莓生長(zhǎng)狀態(tài)和基質(zhì)干濕情況，每隔5～7 d進(jìn)行補(bǔ)施病原菌，一共澆灌3次。

在處理組接種病原菌50 d后進(jìn)行樣品采集。患病葉柄的選擇：截取包含病斑的10 mm長(zhǎng)的葉柄段，病斑長(zhǎng)度為5.1～10.0 mm。每株草莓只收集1個(gè)葉柄，5株草莓即5個(gè)葉柄段為1組，處理組和對(duì)照組各3組重復(fù)。采集到的樣品在液氮迅速冷凍，-80℃冷藏備用。

1.4 轉(zhuǎn)錄組分析

1.4.1 草莓葉柄RNA提取

將采取的樣品用干冰盒包裝好，送上海派森諾生物科技股份有限公司提取 RNA和測(cè)序。利用瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)RNA完整性。

1.4.2 草莓葉柄cDNA文庫(kù)構(gòu)建和質(zhì)控

用Oligo（dT）磁珠富集總RNA中帶有polyA結(jié)構(gòu)的mRNA，采用離子打斷的方式，將RNA打斷成200～300 bp片段。以RNA為模板，用6堿基隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，并以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，第二鏈cDNA合成時(shí)，其中的堿基T，被替換成U，從而達(dá)到鏈特異性文庫(kù)的目的。

文庫(kù)構(gòu)建完成后，采用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)片段富集，之后根據(jù)片段大小進(jìn)行文庫(kù)選擇，文庫(kù)大小在300～400 bp。接著，通過(guò)Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，再對(duì)文庫(kù)總濃度及文庫(kù)有效濃度進(jìn)行檢測(cè)。然后根據(jù)文庫(kù)的有效濃度以及文庫(kù)所需數(shù)據(jù)量，將含有不同Index序列的文庫(kù)按比例進(jìn)行混合。混合文庫(kù)統(tǒng)一稀釋到2 nmol/L，通過(guò)堿變性，形成單鏈文庫(kù)。

1.4.3 高通量測(cè)序

草莓葉柄的轉(zhuǎn)錄組分析： 利用第二代測(cè)序技術(shù)，基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)庫(kù)進(jìn)行雙末端 （paired-end，PE）測(cè)序。將測(cè)序得到的原始讀序（raw reads）經(jīng)過(guò)截除reads中的測(cè)序接頭以及引物序列，過(guò)濾低質(zhì)量值數(shù)據(jù)等處理，獲得高質(zhì)量的干凈讀序（clean reads），確保數(shù)據(jù)質(zhì)量。進(jìn)行堿基組成和堿基質(zhì)量分析，控制數(shù)據(jù)質(zhì)量。

提取每個(gè)基因下最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為該基因的代表序列，稱為Unigene。對(duì) Unigene 進(jìn)行基因功能注釋。基因功能注釋所用到的數(shù)據(jù)庫(kù)包括NR（NCBI non-redundant protein sequences）、GO （gene ontology）、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genome）、eggNOG（evolutionary genealogy of genes： non-supervised orthologous groups）、Swiss-Prot。

1.4.4 差異基因的篩選

采用DESeq對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，篩選差異表達(dá)基因條件為：表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|>1，顯著性 P-value<0.05。

1.4.5 差異表達(dá)基因的GO功能顯著性富集分析

采用BLAST2 GO軟件將差異基因映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的各個(gè)分類，計(jì)算每個(gè)分類中的差異基因數(shù)目，以整個(gè)基因組為背景，采用超幾何分布計(jì)算差異基因顯著富集的GO分類信息。

1.4.6 差異表達(dá)基因的 KEGG 通路富集顯著性分析

將差異基因與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得差異表達(dá)基因主要參與的代謝途徑和信號(hào)通路。以整個(gè)基因組為背景，采用超幾何分布計(jì)算差異基因顯著富集的通路。

1.4.7 差異表達(dá)基因的熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證

綜合分析NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，并結(jié)合本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提供的信息，對(duì)轉(zhuǎn)錄組中20個(gè)可能與植物抗性或者病原菌侵染過(guò)程等機(jī)制相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，并對(duì)其進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。

利用 Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)qPCR引物，以草莓β-actin作為內(nèi)參基因（表1）。用PrimeScriptTM 1st stand cDNA Synthesis Kit將檢測(cè)合格并定量的草莓葉柄總RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系（20 μL）： cDNA 1 μL、上下游引物各 0.8 μL、2×SYBR real-time PCR premixture 10 μL，加超純水補(bǔ)足至20 μL。熒光定量PCR的擴(kuò)增條件為 95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 15 s，60℃延伸 30 s，循環(huán) 40 次。每份樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。整個(gè)流程由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌侵染草莓植株

‘紅顏草莓在接種病原菌45 d后，葉柄開始發(fā)病，在接種50 d后處理組中超過(guò)半數(shù)的草莓葉柄出現(xiàn)了明顯的紅褐色病斑（圖1），此時(shí)采集樣品進(jìn)行分析。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

通過(guò)RNA-seq技術(shù)對(duì)健康草莓葉柄（CK1、CK2、CK3）和患病草莓葉柄（D1、D2、D3）的6個(gè)樣品進(jìn)行分析，獲得的序列數(shù)據(jù)見表2。

將上述序列進(jìn)行拼接和分析，共獲得86 988個(gè)Unigene序列。 分別在NR數(shù)據(jù)庫(kù)、GO數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)Unigene序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)有4 364個(gè)序列全部獲得注釋（表3）。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

將健康草莓葉柄（CK）與患病草莓葉柄（D）的差異基因進(jìn)行雙向聚類分析（圖2），結(jié)果顯示聚類結(jié)果良好。對(duì)二者差異基因的表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，顯著差異表達(dá)基因的數(shù)目是2 127個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)數(shù)量是1 021個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量是1 106個(gè)，上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量略低于下調(diào)表達(dá)基因。大量的基因在草莓響應(yīng)炭疽病時(shí)呈現(xiàn)差異表達(dá)模式，表明草莓響應(yīng)炭疽病是多基因共同作用的復(fù)雜過(guò)程。

2.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析，一共比對(duì)到了1 122個(gè)GO功能條目，篩選出p值小于0.01的68個(gè)條目進(jìn)行后續(xù)分析。 這68個(gè)條目分為3大類功能，生物學(xué)過(guò)程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function），每類功能分別包括26個(gè)、14個(gè)和10個(gè)功能亞組，圖3展示了每類功能之下的10個(gè)功能亞分組。

分析發(fā)現(xiàn)，感染炭疽菌的草莓葉柄的光合作用過(guò)程受到了極大的影響，這一結(jié)果和病癥相對(duì)應(yīng)。炭疽菌侵染到草莓葉柄處，逐漸積累到一定程度時(shí)會(huì)在葉柄外部出現(xiàn)紅褐色病斑，嚴(yán)重影響正常的光合作用，進(jìn)而草莓的很多生長(zhǎng)代謝過(guò)程也會(huì)出現(xiàn)異常。分子功能中的氧化還原酶活性功能，還有生物學(xué)過(guò)程中的氧化還原過(guò)程都富集了大量的差異表達(dá)基因等，這二者都是植物抗逆反應(yīng)中重要的環(huán)節(jié)[9]，說(shuō)明在草莓應(yīng)答炭疽病的過(guò)程中，氧化還原反應(yīng)很可能發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。

2.5 差異表達(dá)基因的 Pathway 富集分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)可以分析差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究中有556個(gè)DEGs映射到154個(gè)pathway，圖4中展示差異顯著的前20個(gè)通路，包括光合作用、碳代謝、光合生物中的碳固定、光合作用觸角蛋白質(zhì)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、類黃酮生物合成、谷胱甘肽代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、牛磺酸和次牛磺酸代謝、氨基酸的生物合成、苯丙醇生物合成、細(xì)胞色素P450對(duì)外源物的代謝、藥物代謝細(xì)胞色素P450、乙醛和二羧酸代謝、甲烷代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、糖酵解/糖異生、戊糖磷酸途徑以及倍半萜和三萜生物合成。

從差異表達(dá)基因的富集程度可以看出，其主要還是集中在植物正常生長(zhǎng)的代謝途徑中，包括光合作用、牛磺酸和次牛磺酸代謝、倍半萜和三萜生物途徑等，這表明病原菌的入侵嚴(yán)重干擾了植物的正常生長(zhǎng)，尤其是光合作用。同時(shí)，與植物抵御非生物及生物脅迫有關(guān)的途徑，包括類黃酮生物合成、谷胱甘肽代謝以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都有差異表達(dá)基因的富集，而在類黃酮途徑中更是有超過(guò)三分之一的基因出現(xiàn)了變化，充分說(shuō)明炭疽菌侵染后，觸發(fā)了草莓體內(nèi)的抗性反應(yīng)[1011]，而類黃酮途徑可能起到了關(guān)鍵性的作用。

2.6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

利用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，選取了20個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。分析結(jié)果顯示（圖5），有19個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢(shì)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，表明 RNA-Seq 分析結(jié)果可靠。雖然差異基因的表達(dá)倍數(shù)略有不同，但這可能與兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍和靈敏度不同有關(guān)。

19個(gè)差異表達(dá)基因中包含10個(gè)上調(diào)基因和9個(gè)下調(diào)基因。上調(diào)基因包括：1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶（ACS）、2-氨基乙硫醇雙加氧酶（ADO）、過(guò)氧化物酶21（POD21）、無(wú)色花色苷雙加氧酶（LDOX）、查爾酮合酶（FrCHS5）、查爾酮黃酮異構(gòu)酶3（CHI3）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶F11（GST F11）、MYB、苯丙氨酸解氨酶1（PAL1）和呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白A（RhoA）;下調(diào)基因有：NF-X1型鋅指蛋白（NF-XL1）、色氨酸合酶α鏈（trpA）、生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白15A（AX15A）、細(xì)胞分裂素脫氫酶5（CKX5）、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基（gpL2）、類胡蘿卜素雙加氧酶4（CCD4）、9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶1（NCED1）、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（rbcL）和葉綠體果糖-1，6-二磷酸酶Ⅰ（cfbI）。

從表達(dá)量上分析，在上調(diào)和下調(diào)基因中各有3個(gè)表達(dá)量倍數(shù)超過(guò)40倍的基因。ACS、POD21和ADO基因，在處理組中表達(dá)倍數(shù)分別是對(duì)照組的927、586和326倍;而trpA、AX15A和CKX5在對(duì)照組的表達(dá)量則是處理組的49、252和271倍。

3 討論

草莓炭疽病是草莓在生長(zhǎng)期內(nèi)面臨的主要威脅之一[1213]，直接影響其生長(zhǎng)發(fā)育，給草莓產(chǎn)量和品質(zhì)帶來(lái)極大危害，培育抗炭疽病的草莓品種是防控病害的最直接有效的方法，能從源頭上預(yù)防炭疽病的發(fā)生[14]。病原菌在侵入寄主植物后，二者在共同進(jìn)化及相互識(shí)別過(guò)程中形成了錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系。病原菌從植物獲得營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)也激發(fā)了植物體內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)，增強(qiáng)其抗病性，從而達(dá)到抵制病原菌入侵的目的。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者從轉(zhuǎn)錄組水平上揭示植物抗病系統(tǒng)中的代謝通路以及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，不僅有助于篩選與鑒定關(guān)鍵作用基因，也為抗病性育種提供了有力支持[1517]。

本研究利用高通量測(cè)序手段，在轉(zhuǎn)錄組水平上分析健康草莓葉柄和患炭疽病草莓葉柄的差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)草莓應(yīng)答病原菌的過(guò)程中，共有2 127個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)顯著差異，其中有1 021個(gè)差異基因的表達(dá)水平顯著升高，1 106個(gè)差異基因的表達(dá)水平顯著下降。GO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，當(dāng)炭疽病菌在進(jìn)入草莓體內(nèi)后，草莓植株的正常生長(zhǎng)受到了極大的影響，多個(gè)代謝通路的基因表達(dá)發(fā)生了改變。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組差異基因分析結(jié)果，挑選了20個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，有19個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，可以進(jìn)行后續(xù)分析。通過(guò)差異基因和代謝通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)本研究中‘紅顏草莓應(yīng)答炭疽菌主要涉及活性氧的平衡調(diào)節(jié)、乙烯的生物合成以及植物正常發(fā)育等生理過(guò)程。

3.1 活性氧平衡與草莓應(yīng)答炭疽病密切相關(guān)

正常條件下，植物體內(nèi)活性氧 ROS 的生成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)植物遭遇脅迫時(shí)，穩(wěn)態(tài)被破壞，大量的 ROS （主要由NADPH氧化酶催化產(chǎn)生，NADPH氧化酶由Rbohs編碼合成[18]）迅速累積，使植物細(xì)胞受到氧化損傷[19]。為了維持平衡，植物會(huì)通過(guò)兩種方式清除活性氧，第一種是酶促清除系統(tǒng)，通過(guò)抗氧化酶（SOD、GST、CAT和POD等）將活性氧分解;第二種是非酶系統(tǒng)的抗氧化次級(jí)代謝物，他們可以與活性氧發(fā)生反應(yīng)，直接清除ROS，例如多酚、類黃酮、類胡蘿卜素等[20]。

根據(jù)本研究結(jié)果，我們認(rèn)為草莓接種炭疽菌后，上述兩種方式都會(huì)開始工作，進(jìn)行活性氧的清除。在酶促清除系統(tǒng)中，草莓主要通過(guò)體內(nèi)過(guò)氧化物氧化酶POD21來(lái)進(jìn)行。POD是活性氧酶促清除系統(tǒng)中常見的酶，可以分解體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，它與植物的抗逆境能力有著密切的聯(lián)系。大豆在重度干旱脅迫下，葉片內(nèi)POD活性最高[21];馬鈴薯[22]和番茄[23]在受到病原菌侵染后，葉片POD活性較未接種對(duì)照均有顯著提高。在本試驗(yàn)中其表達(dá)量在炭疽菌侵染后升高到對(duì)照的586倍，足以證明POD21在活性氧清除過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。

在第二種方式中，草莓體內(nèi)主要起作用的則是類黃酮物質(zhì)。類黃酮代謝途徑是植物抵抗病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)之一，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，海島棉在接種枯萎病菌之后，類黃酮代謝通路中的多個(gè)相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生了顯著升高，同時(shí)認(rèn)為此通路與海島棉的抗性相關(guān)[24]。在本試驗(yàn)中，類黃酮代謝途徑（包括上游的苯丙烷類代謝途徑）的相關(guān)基因PAL1、LDOX、FrCHS5與CHI3均在處理組中發(fā)生了上調(diào)，因此推測(cè)當(dāng)草莓受到病原菌侵染，上述基因發(fā)生上調(diào)，加速了類黃酮物質(zhì)[10]的積累，從而清除ROS，維持ROS的平衡，緩解了炭疽菌給植物帶來(lái)的氧化傷害，增強(qiáng)了草莓對(duì)病菌的抗性。

值得注意的是，草莓被炭疽菌侵染后，2-氨基乙硫醇雙加氧酶ADO的表達(dá)量上升到對(duì)照的326倍。ADO可以將半胱氨酸氧化成次牛磺酸（hypotaurine， HT），后者在動(dòng)物體內(nèi)是一種強(qiáng)抗氧化劑[25];盡管次牛磺酸在植物中的研究很少，但是也有類似的作用。有研究證實(shí)，水稻幼苗經(jīng)過(guò)HT的處理能夠降低堿脅迫下葉片中活性氧的積累，緩解其對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用[26]。ADO表達(dá)量的大量增加，很可能預(yù)示著其在應(yīng)答過(guò)程中會(huì)起到一定的關(guān)鍵作用，所以說(shuō)其作用機(jī)制是值得關(guān)注的一個(gè)新的研究點(diǎn)，它能否對(duì)活性氧平衡發(fā)揮作用則需要進(jìn)一步的研究探索。

3.2 ACS在草莓應(yīng)答炭疽病中發(fā)揮作用

乙烯是植物體內(nèi)一種重要的氣態(tài)激素，參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)過(guò)程，也在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。ACS是乙烯生物合成過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控酶，它催化SAM（S-腺苷甲硫氨酸）合成乙烯前體ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸），ACC在 ACC氧化酶的作用下氧化生成乙烯。耿夙的研究發(fā)現(xiàn)，在輪紋病菌侵染蘋果果實(shí)后，ACS5a、ACS5b、ACS4被大量誘導(dǎo)表達(dá)，乙烯也被大量誘導(dǎo)合成[27]。這和本研究結(jié)果類似，當(dāng)炭疽菌侵染草莓后，ACS基因的表達(dá)量驟然上升到對(duì)照的927倍，是所有差異表達(dá)基因中表達(dá)倍數(shù)最高的基因。推測(cè)ACS基因的顯著上調(diào)會(huì)導(dǎo)致ACC的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乙烯的合成，而乙烯的累積會(huì)促進(jìn)草莓體內(nèi)逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，起到防御炭疽菌侵害的作用[28]。

3.3 植物正常生長(zhǎng)受到抑制

色氨酸合酶由兩個(gè)不同的亞基組成，α-亞基和β-亞基依次催化色氨酸生物合成的最后兩個(gè)步驟[29]，并且色氨酸合酶還參與了甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成;生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因編碼合成植物特有的生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白 SAUR （small auxin up RNA），而且此基因在生長(zhǎng)旺盛的部位表達(dá)量要高于其他部位[30];細(xì)胞分裂素脫氫酶是分解細(xì)胞分裂素的唯一降解酶[3132]。因此，我們推測(cè)，當(dāng)炭疽菌侵染草莓后，草莓體內(nèi)涉及正常生長(zhǎng)的一些基因發(fā)生了重大改變。色氨酸合酶 α鏈基因trpA的下調(diào)，表明色氨酸合酶α-亞基會(huì)受到影響，進(jìn)而影響植物體內(nèi)包括色氨酸在內(nèi)的多個(gè)氨基酸的合成和代謝;AX15A的顯著下調(diào)會(huì)導(dǎo)致SAUR的缺乏，無(wú)法響應(yīng)生長(zhǎng)素信號(hào);而CKX 5表達(dá)量的下降，導(dǎo)致細(xì)胞分裂素在草莓體內(nèi)失去代謝平衡。所以，這3個(gè)基因的顯著下調(diào)，影響了植物激素和氨基酸代謝途徑，最終導(dǎo)致草莓的生長(zhǎng)受到阻礙，出現(xiàn)植株矮小、根系不發(fā)達(dá)等現(xiàn)象。

本文通過(guò)RNA-seq分析和qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了一些與草莓應(yīng)答炭疽病相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中表達(dá)量有顯著差異的基因有6個(gè)，分析推測(cè)這些差異基因可能在活性氧平衡、乙烯合成以及植物正常生長(zhǎng)過(guò)程發(fā)揮了重要作用。那么，這些基因在草莓應(yīng)答病原菌過(guò)程中是怎樣發(fā)揮作用的，其調(diào)控機(jī)制又是什么，它們之間又會(huì)形成怎樣的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，尤其是次牛磺酸在植物活性氧清除過(guò)程中所起到的作用是十分值得研究的，所以我們需要進(jìn)一步開展分子試驗(yàn)來(lái)解決這些深層次的問(wèn)題。轉(zhuǎn)錄組分析為深入研究植物病原菌互作提供了良好的平臺(tái)[33]，可以從整體上了解患病草莓與健康草莓在轉(zhuǎn)錄組水平上的差異表達(dá)基因，有助于挖掘草莓防御炭疽病菌的關(guān)鍵基因，為研究草莓應(yīng)答炭疽病的分子機(jī)理提供重要的基因資源，從而為抗性草莓品種的選育提供有力的科學(xué)理論。

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（責(zé)任編輯：田 喆）

收稿日期： 20190302?? 修訂日期： 20190511

基金項(xiàng)目：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特色農(nóng)業(yè)技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目（YGG17067）;山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（201601D202062）

致? 謝： 參加本試驗(yàn)部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

通信作者E-mail：lh1964@126.com

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