雙重RT-PCR法同步檢測單頭異沙葉蟬攜帶的兩種小麥病毒

杜真真 劉艷 王錫鋒

摘要 異沙葉蟬可傳播小麥矮縮病毒 Wheat dwarf virus（WDV）和小麥黃條紋病毒Wheat yellow striate virus（WYSV）兩種病毒。本文根據WDV和WYSV的基因序列分別設計兩種病毒的特異性引物對，以含有上述兩種病毒的異沙葉蟬樣品總RNA為模板，以隨機引物為3′端通用引物反轉錄獲得cDNA， 然后在同一個PCR反應體系加入兩對引物， 分別得到與預期相符的773 bp和322 bp擴增產物條帶。通過對引物濃度、dNTP和rTaq用量以及退火溫度等條件進行優化，建立了能在同一異沙葉蟬體內檢測WDV與WYSV兩種小麥病毒的雙重RT-PCR方法。該雙重PCR方法特異性強、敏感性高，可以快速準確地在一個體系里同步檢測介體昆蟲體內的兩種病毒，有效地檢測蟲體內病毒帶毒率，這些結果可為病毒預測預報和病害防治提供參考。

關鍵詞 異沙葉蟬; 小麥矮縮病毒; 小麥黃條紋病毒; 雙重RT-PCR

中圖分類號： S 435.12

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019079

Simultaneous detection of two wheat viruses harbored by a single

leafhopper （Psammotettix alienus） by duplex RT-PCR

DU Zhenzhen， LIU Yan， WANG Xifeng

（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

It was found that the leafhopper （Psammotettix alienus） can transmit both Wheat dwarf virus （WDV） and wheat-infecting virus-Wheat yellow striate virus （WYSV）. Here， the specific primer sets for WDV and WYSV were designed according to viral genomic sequences， respectively. Total RNA of leafhopper， which was positive for both WYSV and WDV， was used as a template for the first strand cDNA synthesis. Reverse-transcription was performed using random primer as 3′ primer for each virus. WDV and WYSV specific primer sets was then added into the PCR system producing two distinct fragments of 773 and 322 bp， respectively. A method of duplex reverse-transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） was developed for the simultaneous detection of WDV and WYSV in single leafhopper. The specific reagents and enzymes in the duplex RT-PCR reaction system， primers， dNTPs， and rTaq were first optimized by testing different concentrations and volumes of these components and the annealing temperature was then optimized. Thus， the duplex RT-PCR method optimized in this study was to develop and validate a highly specific and simple RT-PCR method for accurate detection of two viruliferous rates of leafhopper population， which could facilitate better forecasting and control of the virus diseases.

Key words

Psammotettix alienus; Wheat dwarf virus; wheat yellow striate virus; duplex RT-PCR

異沙葉蟬Psammotettix alienus Linnaeus是一種農業害蟲，隸屬于半翅目葉蟬科Cicadellidae沙葉蟬屬Psammotettix [1]。它廣泛分布于歐洲、非洲北部、北美及亞洲中北部地區，同時也是我國西北、華北地區干旱、半干旱地區麥田葉蟬的優勢種[23]。異沙葉蟬不僅通過刺吸小麥、大麥等多種禾本科農作物植株的莖、葉汁液對作物造成危害，更為重要的是它在取食的同時可傳播多種病毒。因此，異沙葉蟬的大發生往往同時伴隨著這些病毒病害的大面積流行，其傳播病毒造成的危害遠大于直接取食，給糧食作物生產帶來了嚴重的損失。

由異沙葉蟬以持久性非增殖方式傳播的小麥矮縮病毒Wheat dwarf virus （WDV） 屬于雙生病毒科Geminiviridae玉米線條病毒屬Mastrevirus的成員之一，病毒全基因組由2 739～2 750個核苷酸組成，為單鏈環狀DNA病毒[45]。感染小麥矮縮病毒的植株多表現嚴重矮化，分蘗增多，甚至無法抽穗。小麥矮縮病是小麥生產上威脅性較大的病害之一，在全世界小麥主產區特別是歐洲各國多次流行造成小麥嚴重減產[6]。此外，近年來發現異沙葉蟬還能以持久性增殖方式傳播小麥黃條紋病毒Wheat yellow striate virus （WYSV）。小麥黃條紋病毒是2016年在陜西韓城田間發現的一種危害小麥的負單鏈RNA新病毒，該病毒基因組全長為14 486 nt，以“N-P-P3-M-G-P6-L”順序依次編碼7種結構蛋白，是彈狀病毒科Rhabdoviridae細胞核彈狀屬病毒Nucleorhabdovirus的暫定種[7]。與被小麥矮縮病毒侵染后產生的癥狀不同，感染小麥黃條紋病毒的小麥無明顯矮化，發病植株葉片沿葉脈失綠、嚴重黃化，并從葉尖干枯開始逐漸發展為整株葉片枯死。WYSV可侵染小麥、大麥以及燕麥等多種麥類作物，是生產上一種潛在的威脅。

帶毒介體的病毒檢測通常采用血清學和分子生物學等手段[810]。血清學具有快速簡便、高通量等優點，但對抗體的特異性有較高要求。分子檢測技術因其快速、靈敏、特異、準確等優點被廣泛應用于帶毒介體的快速檢測和鑒定[1113]。多重PCR是一種PCR衍生方法，它的基本原理、反應試劑和操作均與常規PCR相同，區別在于多重PCR體系中含有2對或多對引物，分別擴增不同模板，可對多個靶標進行同時檢測。本研究針對異沙葉蟬體內攜帶的WDV和WYSV兩種病毒設計特異性引物，優化反應和擴增條件，建立了特異、高效的雙重PCR檢測體系，實現了同一蟲體兩種病毒的同步檢測，為病毒預測預報提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試異沙葉蟬的來源與保存

異沙葉蟬采自陜西韓城普通小麥田塊。經PCR檢測無毒的異沙葉蟬后代種群在健康小麥上扣罩飼養繁殖。WDV和WYSV病毒分離物在小麥品種‘揚麥12上經異沙葉蟬傳毒繁殖，常年保存在22℃±1℃， 20 000 lx的光照培養箱中。無毒異沙葉蟬2齡若蟲取食WDV和WYSV病毒毒株4 d后轉移到健康小麥上備用。

1.2 異沙葉蟬總RNA的提取

將單頭新鮮或冰凍的異沙葉蟬放入1.5 mL離心管中，用帶有無線電動機的研杵（北京天根生化科技有限公司）研磨數秒之后迅速轉移入液氮中冷凍，重復直至異沙葉蟬被充分研磨至粉末狀，然后加入200 μL TRIzol（Invitrogen， USA），劇烈搖晃混勻，冰上靜置5 min;加入40 μL氯仿，用力搖15 s，冰上靜置5 min;4℃，12 000 r/min離心10 min;將上清轉入新的離心管加入與上清等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，冰上靜置10 min;4℃，12 000 r/min離心15 min，去上清;加入500 μL預冷的75%乙醇（滅菌的DEPC水配制），洗滌沉淀。4℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清，重復上述洗滌步驟，以徹底洗干凈鹽分;真空干燥后用15 μL滅菌的DEPC水溶解。

1.3 特異性引物的設計

比對GenBank中已報道的WDV（GenBank no.KJ536138）和WYSV（GenBank no. MG604920）的病毒全基因組序列， 發現這兩種病毒的序列全長分別為2 750 bp和14 486 bp，同源性極低。分別根據兩種病毒的外殼蛋白基因及部分上下游序列區域，應用 Primer Premier 6.0軟件設計這兩種病毒的多對特異性檢測引物，每對引物選擇相似的退火溫度且不同的PCR產物大小及避免二級結構和引物之間的互作，經RT-PCR驗證特異性最終選擇其中兩對引物作為雙重RT-PCR的引物，具體引物信息如表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 單一RT-PCR檢測體系

利用隨機引物反轉錄合成cDNA。cDNA合成體系總體積為20 μL，其中樣品RNA 3 μL，10 μmol/L隨機引物（全式金生物有限公司）1 μL， DEPC H2O 6 μL， 混勻后95℃變性2～3 min，立即置于冰上2 min;然后加入2.5 mmol/L dNTPs 2 μL， 5× M-MLV buffer 4 μL， 200 U/μL M-MLV反轉錄酶（Promega， USA）1 μL，40 U/μL RRI（TaKaRa）0.5 μL，用DEPC H2O補足至20 μL?；靹蚝螅?7℃孵育1 h， 70℃ 10 min，-20℃保存。以合成的cDNA為模板，分別利用WDV和WYSV的特異性引物進行擴增。PCR體系：cDNA 3 μL， 25 mmol/L 10×PCR buffer （Mg2+ plus） 2.5 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL， 10 μmol/L 上下游引物各0.5? μL， 5 U/μL rTaq（TaKaRa） 0.1 μL，用超純水補足至25 μL。擴增程序如下：94℃ 3 min; 94℃ 30 s，55℃ 45 s和72℃ 50 s，35個循環;72℃ 10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時設置無毒異沙葉蟬RNA為陰性對照。

1.5 雙重RT-PCR體系的建立與優化

分別取單一RT-PCR檢測結果為陽性的只攜帶WDV或WYSV的異沙葉蟬RNA各1.5 μL或者是同時攜帶兩種病毒的異沙葉蟬RNA 3 μL，利用1.4中的方法合成cDNA。雙重RT-PCR與單重RT-PCR體系的其他試劑成分和反應條件相同。以只攜帶WDV或WYSV的異沙葉蟬RNA和無毒異沙葉蟬RNA為對照。為了優化雙重RT-PCR體系，以上述合成的cDNA作為雙重PCR反應模板，對rTaq、dNTPs濃度以及退火溫度進行優化，優化某一因子時保持其他條件不變。5 U/μL rTaq DNA 聚合酶設0.1、0.2、0.3、0.4 μL和0.5 μL 5個處理;2.5 mmol/L dNTPs設1、2、3、4 μL和5 μL 5個處理;退火溫度設51、53、55、57℃和59℃ 5個梯度。

1.6 雙重RT-PCR的靈敏度測定

為檢測雙重RT-PCR體系的靈敏度，將濃度為200 ng/μL的cDNA按10倍梯度進行系列稀釋（10-1～10-4），再取3 μL cDNA為模板按照優化后的最佳條件分別進行PCR擴增，通過觀察電泳結果分析雙重RT-PCR檢測的靈敏度。

1.7 雙重RT-PCR的初步應用

從陜西韓城田間采集的17頭異沙葉蟬，分別提取全蟲的總RNA，采用優化的雙重 RT-PCR體系檢測同一頭蟲體里攜帶WDV或WYSV的情況。將獲得的WYSV和WDV擴增產物通過純化回收，連接到pEASY-T5載體上，導入到感受態細胞Trans-T1中，將菌液PCR擴增陽性的樣品送上海生工生物有限公司測序，并利用Vector NT軟件對得到的序列進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 雙重RT-PCR檢測體系的建立

用濃度0.1 μmol/L的WDV和WYSV兩對特異性引物分別對相應病毒的cDNA模板進行單一RT-PCR擴增，分別能夠擴增出773 bp和322 bp特異性條帶，符合設計目的條帶大小。對引物濃度進行了優化，確定了上述兩對特異性引物在同一PCR體系中最佳使用終濃度分別為0.12 μmol/L和0.08 μmol/L，即WDV與WYSV引物對的比例為3∶2。按這個比例將兩種引物加入到體系中，單獨攜帶WYSV或WDV的有毒蟲及和同時攜帶WYSV和WDV的有毒蟲的RNA樣品均能擴增出相應病毒的特異性條帶，且無非特異性條帶，表明兩對引物有良好的兼容性（圖1）。

2.2 雙重RT-PCR檢測體系的優化

以RT-PCR產物為模板，對dNTPS，rTaq以及退火溫度等因子進行進一步優化，確定WDV和WYSV雙重RT-PCR檢測體系最優的條件為：在總體積25 μL的PCR體系中含有3 μL cDNA，2 μL濃度為2.5 mmol/L 的dNTPS、0.1 μL rTaq（5U/μL）以及濃度為10 μmol/L WDV、WYSV上下游引物各0.3 μL和0.2 μL。PCR擴增反應條件為：94℃ 3 min， 94℃ 30 s、55℃ 45 s 和72℃ 50 s共35 個循環;72℃ 10 min（圖2）。

2.3 雙重RT-PCR的靈敏度測定

為檢測雙重RT-PCR體系的靈敏度，將濃度為200 ng/μL的cDNA按10倍系列稀釋（10-1～10-4），結果表明雙重RT-PCR的檢測下限是10-2的cDNA，當稀釋100倍時，雙重檢測體系中WDV的條帶比較模糊，而WYSV的條帶依然清晰。當稀釋了1 000倍時沒有WDV目的條帶出現，結果如圖3。

2.4 雙重RT-PCR的初步應用

用優化好的雙重 RT-PCR體系對來自陜西韓城的17頭葉蟬樣品進行檢測，發現單頭蟲體里既有WDV或WYSV一種病毒單獨存在的情況，也有這兩種病毒同時存在的情況（圖4）。將從雙重RT-PCR體系中獲得的其中3個WYSV 和WDV擴增產物分別通過克隆測序，序列比對表明擴增得到的序列與參考序列一致性均超過了99%，證明了建立的雙重RT-PCR檢測的可靠性。

3 討論

在自然界中，寄主植物往往受到兩種或兩種以上植物病毒的復合侵染，同一介體昆蟲也可以傳播兩種或兩種以上不相關的植物病毒[1415]，這給病毒病害流行監測帶來了一定的困難。PCR方法具有快速、特異、靈敏和重復性好的優點，但是單一PCR方法用于多種病毒感染的田間樣品鑒別診斷時，不能一次達到目的，并且對樣品需求量大，耗時較長。近年來，基于PCR技術建立的多重PCR或RT-PCR檢測方法已廣泛應用到植物病毒的檢測中[1617]，亦被成功地應用于蟲傳植物病毒在介體昆蟲中的檢測，例如在同一灰飛虱體內水稻條紋病毒Rice stripe virus（RSV）和水稻黑條矮縮病毒Rice black-streaked dwarf virus（RBSDV）兩種病毒的檢測[18]。

WYSV是近年來我國西北部麥區新發現的一種可侵染麥類作物的植物彈狀病毒。WDV的傳毒介體異沙葉蟬也是目前發現的可傳播WYSV病毒的唯一介體。異沙葉蟬的帶毒蟲量是這兩種小麥病害發生流行的關鍵因子，因此建立一種快速、靈敏檢測異沙葉蟬帶毒率的方法十分必要。但異沙葉蟬體型較小，成蟲體長僅3～4 mm，單獨提取同一個體較難滿足DNA和RNA的用量。雖然WDV是一種DNA病毒，但其轉錄過程產生的病毒mRNA可以作為RT-PCR的模板[1920]。因此本研究提取異沙葉蟬總RNA，用隨機引物進行反轉錄，一次性合成cDNA作為雙重RT-PCR體系的模板，在同一個反應體系加入兼容性好的兩種病毒特異性引物對進行PCR擴增，組建了WDV與負單鏈RNA病毒WYSV的同步檢測體系。本研究還對引物濃度、dNTPs和rTaq用量以及退火溫度等條件進行了優化，發現兩種引物濃度配比以及dNTPs的用量是該RT-PCR體系的關鍵。建立的雙重RT-PCR方法不僅可以應用于同一異沙葉蟬體內快速同步檢測WYSV和WDV兩種小麥病毒，亦可用于麥類作物樣品中這兩種病毒的檢測，確認單一感染或混合感染，達到快速診斷、鑒別的目的，比常規PCR或RT-PCR方便快捷，節約試劑和降低檢測周期。因此，本方法的建立將為異沙葉蟬帶毒率的檢測及田間小麥矮縮病毒病和小麥黃條紋病毒病的流行監測提供技術支持，服務于小麥蟲傳病毒病害的防治。

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（責任編輯：楊明麗）

收稿日期： 20190225?? 修訂日期： 20190322

基金項目：國家重點研發計劃（2016YFD0300705）;國家自然科學基金（31871938）

致? 謝： 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學，特此一并致謝。

通信作者E-mail：yliu@ippcaas.cn

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