葡萄卷葉伴隨病毒2實時熒光定量RT-PCR技術的檢測應用

任芳 張尊平 范旭東 胡國君 張夢妍 董雅鳳

摘要 通過引物篩選和體系優化建立了葡萄卷葉伴隨病毒2 Grapevine leafroll-associated virus 2（GLRaV-2）的SYBR Green Ⅰ染料法實時熒光定量RT-PCR檢測技術。該技術標準曲線擴增效率為102.2%，決定系數為0.999，最低檢出限可達10-3稀釋梯度，是常規RT-PCR的100倍。對不同季節和不同部位葡萄樣品的檢出率普遍高于常規RT-PCR。春夏秋季樣品檢出率分別為67%、89%和86%，比常規RT-PCR檢出率分別高42%、28%和17%。冬季休眠枝條檢出率最高（100%），與常規RT-PCR相同。夏季老葉柄和卷須、秋季和冬季枝條等樣品檢測效果最好，檢出率均為100%。對來自我國17個省38個品種的116份田間葡萄樣品檢測結果表明，qRT-PCR共檢測到10個樣品為陽性，檢出率略高于常規RT-PCR。

關鍵詞 葡萄; 葡萄卷葉伴隨病毒2; 實時熒光定量RT-PCR; 常規RT-PCR; 檢測

中圖分類號： S 432.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019119

Application of a real-time quantitative RT-PCR for detection of

Grapevine leafroll-associated virus 2

REN Fang， ZHANG Zunping， FAN Xudong， HU Guojun， ZHANG Mengyan， DONG Yafeng

（National Center for Eliminating Viruses from Deciduous Fruit Trees， Research Institute of Pomology，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xingcheng 125100， China）

Abstract

A SYBR GreenⅠ based real-time quantitative RT-PCR （qRT-PCR） method for Grapevine leafroll-associated virus 2 （GLRaV-2） was established. An excellent linear correlation （0.999） and amplification efficiency （102.2%） were obtained from the standard curve. The detection limit of the method was 10-3 dilution fold， which was 100 times higher than that of conventional RT-PCR. The method was subsequently used to detect grapevine samples in different seasons and different positions of plant. The detection efficiency of qRT-PCR for grapevine samples in most seasons and positions were generally higher than that of conventional RT-PCR. The detection rates of qRT-PCR for samples in spring， summer and autumn were 67%， 89% and 86%， which were 42%， 28% and 17% higher than those of conventional RT-PCR， respectively. For dormant branches in winter， the detection rates were the same for the two methods （100%）. In general， the old petioles and tendrils in summer， branches in autumn and winter were the best materials for GLRaV-2 detection by qRT-PCR， with the detection rates of 100%. For field samples （belonging to 38 cultivars） from 17 provinces in China， 10 of 116 samples were detected to be positive by qRT-PCR， and the detection efficiency was higher than that of conventional RT-PCR.

Key words

grapevine; Grapevine leafroll-associated virus 2; qRT-PCR; conventional RT-PCR; detection

葡萄卷葉病是一種世界性病毒病害，也是我國葡萄上的主要病害，由多種葡萄卷葉伴隨病毒Grapevine leafroll-associated virus （GLRaV）引起，其中GLRaV-2和GLRaV-3是我國葡萄卷葉病的主要病原。GLRaV-2屬于長線病毒科Closteroviridae長線病毒屬Closterovirus，為RNA病毒，基因組全長16.5 kb，包含9個ORFs，分別編碼一個大的多聚蛋白、p6、Hsp70h、p63、CPm、CP、p19和p24等蛋白[13]。GLRaV-2除了引起葡萄卷葉病外，還可導致嫁接不親和、部分品種嫁接后死亡和幼樹“速衰”等癥給葡萄生產造成很大危害[45]。除我國外，GLRaV-2在美國、意大利等多個國家普遍發生，且分為多個變異組群，不同分離物間遺傳變異性較大[3，6]，給病毒檢測和防控帶來很大困難。病毒檢測是葡萄病毒病防控的關鍵環節，實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）檢測技術特異性強、靈敏度高，在世界上已經應用多年[5，78]，但我國還未見GLRaV-2 qRT-PCR檢測技術的相關研究報道。本實驗室前期建立的葡萄病毒A Grapevine virus A（GVA）qRT-PCR技術，檢測特異性好且靈敏度高，靈敏度可達到常規RT-PCR的100倍以上[9]，表明該技術在葡萄病毒檢測中具有較好應用前景。因此本研究建立并優化了GLRaV-2的qRT-PCR檢測技術體系，并將其應用到不同季節和不同部位葡萄樣品的檢測中，以期為豐富GLRaV-2檢測手段、提高病毒檢測效率打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以遼寧省興城市中國農業科學院果樹研究所國家落葉果樹脫毒中心毒源保存圃采集的感染GLRaV-2的葡萄樣品（表2）以及來自我國不同葡萄產區的田間葡萄樣品（表3）為試材。

1.2 主要儀器和試劑

本研究所用實時熒光定量PCR儀為CFX ConnectTM Real-Time System（BIO-RAD，美國）。主要試劑10×PCR Buffer、dNTPs、Taq酶、DNA marker DL2000、反轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 和Escherichia coli DH5α感受態購自大連寶生物公司（TaKaRa）;2×SYBR GreenⅠ qPCR Mix、pTOPO-TA載體、膠回收試劑盒購自北京艾德萊生物有限公司。

1.3 總RNA提取及反轉錄

取葡萄樣品約80 mg，采用吸附柱法[10]提取總RNA，-80℃保存。采用反轉錄試劑盒（M-MLV Reverse Transcriptase，TaKaRa），參照任芳等[9]反轉錄方法合成cDNA，-20℃保存。

1.4 引物篩選及克隆驗證

根據文獻報道選擇198F/290R[7]、GLRaV-2F/2R[8]和P19qtF4/P24qtR[5]等3對引物作為本研究GLRaV-2實時熒光定量PCR候選引物（表1）。分別采用常規RT-PCR和qRT-PCR對引物特異性及擴增效果進行比較。qRT-PCR反應體系13 μL，含2× SYBR GreenⅠqPCR Mix 6.25 μL、正反向引物各0.25 μL、DEPC水 5.25 μL 和cDNA 1 μL。反應條件：95℃預變性3 min;95℃ 15 s，58℃15 s，72℃ 20 s，40個循環，熔解曲線分析溫度60～95℃，每5 s增加0.5℃。以擴增曲線Cq值（擴增產物熒光信號達到設定閾值所經過的循環次數）<30且熔解曲線為單一峰時判定為陽性。根據常規RT-PCR和qRT-PCR擴增效果選擇1對引物作為本研究qRT-PCR檢測引物，將所選引物PCR擴增產物割膠回收純化，連接pTOPO-TA載體并轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆送北京諾賽基因組研究中心進行測序，序列比對分析驗證引物正確性。

1.5 qRT-PCR體系優化及標準曲線構建

以10-1倍稀釋的cDNA作為模板，在54.0～64.0℃退火溫度梯度下進行qRT-PCR擴增選擇最佳退火溫度;采用100、200、300、400 nmol/L和500 nmol/L引物濃度進行qRT-PCR擴增選擇最佳引物濃度。在最佳退火溫度和引物濃度下，以1～10-7梯度稀釋的cDNA為模板進行qRT-PCR標準曲線構建。

1.6 qRT-PCR技術的檢測及應用

1.6.1 特異性檢測和靈敏度比較

分別采集感染了葡萄病毒A Grapevine virus A（GVA）、葡萄病毒B Grapevine virus B（GVB）、葡萄病毒E Grapevine virus E（GVE）、GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4、葡萄扇葉病毒Grapevine fan leaf virus（GFLV）、葡萄斑點病毒Grapevine fleck virus（GFkV）和沙地葡萄莖痘病毒Grapevine rupestris stem pitting associated virus（GRSPaV）的葡萄樣品用于qRT-PCR特異性檢測。以GLRaV-2陽性樣品1～10-7梯度稀釋的cDNA 為模板，分別進行常規RT-PCR和qRT-PCR檢測，比較檢測靈敏度。

1.6.2 田間葡萄樣品檢測

選擇感染GLRaV-2的4個品種（‘赤霞珠‘紅地球‘克瑞森無核和‘品麗珠）6株葡萄植株，分別在春夏秋季采集上部（枝條頂端嫩梢從上往下第2、3 片葉）嫩葉、嫩葉柄、下部（枝條基部自下往上第2、3片葉）老葉、老葉柄、卷須和枝條等6個部位樣品，冬季采集休眠枝條，共114個樣品（表2），分別進行常規RT-PCR和qRT-PCR檢測。并收集來自我國17個省38個品種的116份田間葡萄樣品（表3），分別采用常規RT-PCR和qRT-PCR進行檢測。

2 結果與分析

2.1 引物篩選及克隆驗證

選擇16個感染GLRaV-2的葡萄樣品采用3對引物進行常規RT-PCR檢測。電泳結果表明，引物198F/290R僅有7個樣品擴增到目的條帶，且目的條帶與引物二聚體區分不明顯;引物GLRaV-2F/2R有1個樣品未擴增到目的條帶，且有4個樣品條帶較弱;引物P19qtF4/P24qtR擴增效果最好，16個樣品全為陽性且特異性好（圖1）。

同時將上述樣品進行qRT-PCR檢測，結果表明引物198F/290R僅6個樣品為陽性;引物GLRaV-2F/2R16個樣品均獲得擴增曲線，為陽性，但陰性對照也有擴增曲線，表明該引物特異性較差，易導致樣品假陽性產生;引物P19qtF4/P24qtR檢測16個樣品全為陽性，且健康對照為陰性，特異性較好。

綜上，常規RT-PCR和qRT-PCR擴增效果最好的引物均為P19qtF4/P24qtR。將引物P19qtF4/P24qtR擴增6個陽性樣品的擴增產物回收克隆并測序，共獲得6個克隆序列，經NCBI BLAST分析及DNAStar軟件比對，所獲得6個克隆序列分為兩組，其中1組包含3個克隆序列，與已報道的GLRaV-2 PN（AF039204）及14G463（MH814501）等多個分離物目標片段序列一致，同源性為100%。另一組3個克隆序列則與GLRaV-2 RG（登錄號AF314061）及12G4102（MH814500）等分離物對應片段序列一致，同源性為100%。表明本研究所選引物擴增片段與GLRaV-2目的片段正確匹配，可用于下一步GLRaV-2 qRT-PCR檢測。

2.2 qRT-PCR體系優化及標準曲線構建

不同退火溫度下，相同樣品Cq值差異較?。?1.56～21.88），56.0℃和57.9℃兩個溫度的相對熒光強度最強，選擇58℃作為本研究GLRaV-2最佳退火溫度。不同引物濃度下，300 nmol/L和400 nmol/L時Cq值和相對熒光強度相近且優于其余3個濃度，但300 nmol/L擴增陰性對照Cq值更低，因此選擇300 nmol/L作為本研究GLRaV-2最佳引物濃度。

在最佳退火溫度和引物濃度條件下擴增梯度稀釋樣品并構建標準曲線。結果表明，1～10-4倍稀釋樣品擴增曲線呈梯度分布，標準曲線Cq值與模板濃度線性關系良好，擴增效率和決定系數均較高（E=102.2%，R2=0.999）（圖2）。

2.3 qRT-PCR檢測特異性及靈敏度

用建立的qRT-PCR方法檢測分別感染GLRaV-2和其他9種葡萄病毒的樣品，只有GLRaV-2感染樣品為陽性，Cq值19.11，熔解曲線為單一峰，其余樣品為陰性，表明其可特異性檢測GLRaV-2。檢測梯度稀釋的GLRaV-2陽性樣品時，常規RT-PCR最低只能檢測10-1倍稀釋樣品，而qRT-PCR

檢測10-3倍稀釋樣品時Cq值仍小于30，為陽性，檢測靈敏度可達普通RT-PCR的100倍（圖3）。

2.4 不同季節和不同部位葡萄樣品檢測

qRT-PCR和常規RT-PCR兩種方法對感染GLRaV-2的6株葡萄植株不同季節和部位共114個樣品（表2）檢測結果及各季節和各部位樣品平均檢出率（圖4）對比結果表明，兩種方法對冬季休眠枝條檢測效果相當且檢出率最高（均為100%），對其余各季節和部位樣品qRT-PCR檢出率均高于常規RT-PCR。尤其是對春季樣品，RT-PCR檢出率很低，而qRT-PCR檢出率可達67%，比常規RT-PCR提高了42百分點。qRT-PCR對夏季和秋季樣品檢測效果相當，檢出率達89%和86%，分別比常規RT-PCR高28百分點和17百分點。不同部位樣品比較，qRT-PCR對老葉、老葉柄、卷須和枝條樣品檢出率相當（83%～88%），嫩葉檢出率最低，但所有部位樣品檢出率均高于常規RT-PCR（圖4）。綜合比較各季節各部位樣品檢測效果，qRT-PCR對夏季老葉柄、卷須、秋季枝條和冬季休眠枝條檢出率最高，均達100%，其次為夏季和秋季其余部位樣品及春季老葉樣品，檢出率均為83%（表2）。

2.5 不同產區葡萄田間樣品檢測

對來自17個省不同產區38個品種的116份田間葡萄樣品（表3）分別進行了常規RT-PCR和qRT-PCR檢測，常規RT-PCR有8個樣品檢測為陽性，檢出率6.9%，qRT-PCR共檢測到10個樣品為陽性，其中包括常規RT-PCR檢測為陽性的8個樣品，qRT-PCR檢出率8.6%，略高于常規RT-PCR。

3 討論

本研究根據文獻報道的引物篩選及體系優化建立了GLRaV-2的qRT-PCR檢測技術，檢測靈敏度可達常規RT-PCR的100倍，與本實驗室建立的GVA[9]等葡萄病毒qRT-PCR檢測靈敏度相當，并且采用減半反應體系13 μL，降低了試劑耗材等檢測成本。為了檢驗該技術的實際應用效果，我們對不同季節、不同部位以及不同產區不同品種的葡萄樣品進行了檢測。結果表明，GLRaV-2 qRT-PCR檢測技術極大地提高了對不同季節或部位樣品的檢測效果，春夏秋季樣品檢出率比常規RT-PCR提高了17～42百分點，對不同部位的樣品檢出率比常規RT-PCR提高了9～39百分點。對來自我國遼寧、山東、河北等17個省38個品種的116個田間葡萄樣品檢測結果也表明，其與常規RT-PCR檢測結果基本一致且檢出率更高。同時，研究結果還可為選擇GLRaV-2檢測或脫毒的最佳取樣時間或部位提供參考依據，在一定程度上提高病毒檢測準確率，減少漏檢情況的發生，如夏季老葉柄、卷須、秋季枝條和冬季休眠枝條檢測效果最好，檢出率均達100%，其次為春季老葉和夏秋季其余部位樣品。與之相反，在選擇材料用于葡萄病毒脫除時，則可選擇春季幼嫩組織以提高脫毒效率。不同葡萄病毒在不同季節或部位葡萄樣品中的檢測效果也有所不同，如GVA在不同季節間檢出率差異較明顯，大多部位在春夏季較低，在秋冬季較高[9]，而本研究采用qRT-PCR檢測GLRaV-2，檢出率除春季外，其余季節間無明顯差異，與GLRaV-3夏季濃度最高，生長季末期檢出率較高等

特征較一致[11]。GLRaV-2各部位間檢出率差異也較小，但嫩葉檢出率較低這一點與GVA一致，與GFLV不同[12]。影響不同病毒和不同葡萄樣品檢測效果的因素目前尚不清楚，是否與病毒種類有關以及是否與病毒在寄主體內的時空分布規律呈正相關等有待于下一步研究。

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（責任編輯：楊明麗）

收稿日期： 20190312?? 修訂日期： 20190712

基金項目：國家重點研發計劃（2019YFD1001800）;國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-29-bc-1）

致? 謝： 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學，特此一并致謝。

通信作者E-mail：yfdong@163.com

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