Cf-2/Rcr3pim番茄品系對南方根結線蟲的抗性測定

丁修恒 王暄 李紅梅 周仁鵬 陳聰

摘要 Cf-2/Rcr3pim基因型番茄不僅能夠抵御番茄葉霉菌的侵染，而且對馬鈴薯金線蟲的寄生也有一定的抑制效果。為挖掘根結線蟲的新抗性資源，本研究采用室內人工接種法測定了Cf-0/Rcr3pim、Cf-2/Rcr3-3和Cf-2/Rcr3pim 基因型番茄品系對南方根結線蟲的抗感性。抗性評價結果顯示，Cf-0/Rcr3pim 品系對南方根結線蟲表現高感，Cf-2/Rcr3-3品系為中感，而Cf-2/Rcr3pim品系則為感病。與Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3-3基因型相比，Cf-2/Rcr3pim基因型番茄品系雖然對南方根結線蟲侵染的敏感性略低，但是不能阻止線蟲在根系上的大量繁殖，不適于根結線蟲的防控應用。

關鍵詞 南方根結線蟲; Cf-2/Rcr3pim 基因型; 抗性測定; 人工接種; 根結指數

中圖分類號： S 436.412， S 432.45

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019130

Evaluation of resistance in tomato lines with genotype

Cf-2/Rcr3pim to Meloidogyne incognita

DING Xiuheng， WANG Xuan， LI Hongmei， ZHOU Renpeng， CHEN Cong

（Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests， Ministry of

Education， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract

The Cf-2/Rcr3pim genotype tomato can not only resist the infection of Cladosporium fulvum， but also can inhibit the parasitism of Globodera rostochiensis. In order to explore the new resistant resources for root-knot nematodes， the resistance of Cf-0/Rcr3pim， Cf-2/Rcr3-3 and Cf-2/Rcr3pim genotype tomato lines to Meloidogyne incognita was determined by the greenhouse inoculation test. The resistance evaluation showed that the Cf-0/Rcr3pim line was highly susceptible to M.incognita， while the Cf-2/Rcr3-3 line was moderately susceptible， and the Cf-2/Rcr3pim line was susceptible. Although Cf-2/Rcr3pim genotype tomato line was less susceptible to the infection of M.incognita when compared with the Cf-0/Rcr3pim and Cf-2/Rcr3-3 lines， it failed to prevent the mass reproduction of nematodes on the roots， indicating it is unsuitable for root-knot nematodes control.

Key words

Meloidogyne incognita; Cf-2/Rcr3pim genotype; resistance evaluation; artificial inoculation; gall index

根結線蟲Meloidogyne spp.是一類重要的植物寄生線蟲，侵染的植物種類達3 000種以上[1]，嚴重危害農作物的產量和品質，每年造成全球作物經濟損失高達100億美元[2]。根結線蟲已報道的種類達98個[3]，其中，分布廣泛、危害嚴重的種類主要有南方根結線蟲 M.incognita、花生根結線蟲 M.arenaria、爪哇根結線蟲 M.javanica和北方根結線蟲M.hapla等4種[4]。根結線蟲的防治，對于穩定糧食安全和保障人類生活品質都具有重要的意義。

根結線蟲的綜合治理策略包括植物檢疫、農業防治、物理防治、生物防治、抗性品種利用以及化學防治等，其中，種植抗性品種是最為經濟有效的防治手段，許多國家對根結線蟲的抗性育種和品種選育工作都非常重視[5]。雖然根結線蟲的抗性基因在多種作物中都有報道，但真正應用于農業生產的抗性資源仍然十分有限。目前商業化應用最為成功的是Mi-1基因[67]，該基因源自野生秘魯番茄Solanum peruvianum，對南方根結線蟲、爪哇根結線蟲和花生根結線蟲3個種均有抗性[8]。然而，單一抗源品種如果長期連續種植，極易造成根結線蟲突破Mi-1基因抗性而成為毒性群體，導致品種抗性喪失[911]，此外，Mi-1基因在土壤溫度高于28℃時就會喪失對根結線蟲的抗性，不利于保護地栽培以及夏季高溫炎熱地區的農作物種植[1213]，因此，發掘根結線蟲新的抗性資源和材料對根結線蟲防控尤為迫切。

Cf-2/Rcr3pim是來自醋栗番茄Solanum pimpinellifolium的一對基因，Cf-2/Rcr3pim共同介導了番茄對葉霉菌Cladosporium fulvum的抗性，其作用機制符合“警戒假說（guard hypothesis）”，即木瓜類半胱氨酸蛋白酶（papain-like cysteine proteases，PLCPs）Rcr3pim能夠識別葉霉菌無毒蛋白Avr2，從而激發Cf-2介導的番茄對葉霉菌的抗性[14]。Cf-2/Rcr3pim番茄在防御馬鈴薯金線蟲Globodera rostochiensis侵染的過程中也具有相似的作用，即馬鈴薯金線蟲分泌一種類毒液過敏原蛋白（venom allergen-like protein，VAP）GrVAP1，番茄的Rcr3pim能夠與GrVAP1特異性地結合，激發Cf-2介導的抗性反應，進而有效減少馬鈴薯金線蟲成功侵染的數量[15]。

已有研究證實根結線蟲同樣分泌VAP蛋白[1617]，Cf-2/Rcr3pim番茄是否能夠利用上述類似機制來抵抗根結線蟲的侵染目前尚不明確，本文以Cf-2/Rcr3pim基因的3個不同番茄品系為研究材料，測定其對南方根結線蟲的抗感性，以期為發掘根結線蟲的新抗源提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試番茄品系Cf-0/Rcr3pim、Cf-2/Rcr3-3、Cf-2/Rcr3pim分別為番茄品種‘MoneyMaker的3種不同基因型[15]，由荷蘭瓦赫寧根大學Jose L. Lozano Torres博士饋贈，表達Mi-1基因抗性番茄品種‘Tanaki由比利時國家農業漁業研究所（ILVO）Nancy de Sutter女士饋贈，番茄感病品種‘Hezuo903購自江蘇省農業科學院。

將供試番茄種子分別浸泡在5.32×10-5mol/L NaClO 溶液中消毒 2 min后，用無菌水清洗5次，置于25℃墊有濕潤濾紙的培養皿中催芽。3 d后將發芽的種子播種于盛有滅菌土（土∶細沙∶營養土=3∶3∶1）的塑料杯中 （直徑7 cm×高度12 cm），20～25℃日光溫室培養番茄至6葉期，用于RNA提取和線蟲接種。

供試南方根結線蟲群體采自江蘇省淮安市丁集鎮的黃瓜根部，經單卵塊純化及種類鑒定后，接種于感病番茄‘Hezuo903，置于25℃日光溫室繁殖。45 d后收集番茄根部的卵塊，置于25℃培養箱，收集孵化的2齡幼蟲制成懸浮液，用于線蟲的接種。

1.2 番茄材料的Cf-2和Rcr3pim基因檢測

采用RT-PCR法對供試番茄材料進行基因型檢測。取6葉期植株的根系，用Plant RNA Kit （Omega，USA）提取根系的總RNA，用5×All-In-One RT MasterMix試劑盒（abm， Canada）將總RNA反轉錄合成cDNA，提取和反轉錄按試劑盒說明進行操作。以番茄根系cDNA為模板，用Cf-2基因的特異性引物Cf-2Fw/Cf-2Rv[15]和Rcr3pim基因的Rcr3pimf/Rcr3r[18]進行RT-PCR檢測，以番茄actin基因（1 084 bp）為內參[15]（表1）。RT-PCR反應體系：2×Ex Taq mix 12.5 μL、正反向特異性引物各2 μL和模板1 μL，加雙蒸水定容至25 μL。擴增條件：95℃預變性4 min;95℃變性30 s，60～65℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，循環35次;最后72℃延伸10 min。用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳30 min（電壓120 V），溴化乙錠染色15 min后，在凝膠成像系統下觀察并拍照。

1.3 測定番茄材料對根結線蟲抗感性

參照戴均濤等[19]的方法測定供試番茄材料對根結線蟲的抗感性。接種線蟲前，在6葉期番茄距離苗莖基部2 cm處土壤均勻打4～6 cm深的小孔4個，每孔各接100條2齡幼蟲（J2），每株苗接種400條J2。各番茄材料設6個重復。將接種后的番茄幼苗置于20～25℃溫室中，正常光照，定期澆施營養液。

接種45 d后，從塑料杯中取出番茄植株，剪去地上部，洗凈根系后，用1.04×10-4 mol/L臺盼藍（Trypan Blue）溶液浸泡 20 min，清水洗去多余染色液后用吸水紙吸干，分別統計每株番茄根系上的根結數、卵塊數以及有根結的根在總根系中的占比。從每株番茄根系上隨機挑取6個卵塊，置于含有5.32×10-5mol/L NaClO 溶液的12孔板中，在體視鏡（SMZ-168）下統計單卵塊中的卵量;每品系重復3次。用酸性品紅染色法[20]對上述根系染色，在體視鏡下統計根內雌蟲數;每品系重復3次。

番茄抗根結線蟲的評價分級標準參照王新榮等[21]的方法， 即根據番茄形成根結的根數占整個根系的百分比（根結率），將番茄抗根結線蟲等級分為6 級：0級，免疫（I，根結率為0）;1級，高抗（HR，根結率為1%～5%）;2級，抗病（R，根結率為6%～25%）;3級，感病（S，根結率為26%～50%）;4級，中感（MS，根結率為51%～80%）;5級，高感（HS，根結率>81%）。根結指數的計算公式為：根結指數=∑（各級病株數×各級代表值）/（調查總株數×最高嚴重度代表值）×100。

1.4 數據分析

采用SPSS 10.0進行數據處理，用Duncan氏新復級差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 番茄材料的Cf-2和Rcr3pim基因檢測

為了確認Cf-2/Rcr3pim、Cf-2/Rcr3-3和Cf-0/Rcr3pim基因型番茄品系中的Cf-2和Rcr3pim基因表達水平是否有差異，我們以番茄actin基因為內參，用表1的Cf-2和Rcr3pim基因特異性引物對供試番茄材料進行檢測。結果顯示，從Cf-2/Rcr3pim品系中能分別擴增出約370 bp和400 bp的片段，與預測片段大小一致，表明Cf-2和Rcr3pim基因在根系組織中均有表達，其中Cf-2表達水平相對較低;從Cf-2/Rcr3-3品系中僅擴增出約370 bp的Cf-2基因片段，沒有擴增出Rcr3pim基因的片段;從Cf-0/Rcr3pim品系中僅能擴增出約400 bp的Rcr3pim基因片段，未檢測到Cf-2基因的表達;而從根結線蟲感病番茄‘Hezuo903和抗病番茄‘Tanaki中均未檢測到Cf-2和Rcr3pim基因的表達（圖1）。

2.2 番茄材料的根結線蟲繁殖情況統計

接種南方根結線蟲45 d后，觀察不同番茄品系上的線蟲繁殖情況并進行統計分析，結果顯示，僅表達Rcr3pim基因的Cf-0/Rcr3pim品系形成根結數量最多，平均為180.6個/株， 僅表達Cf-2基因的‘Cf-2/Rcr3-3品系形成的根結數為145.1個/株，而同時表達Cf-2和Rcr3pim基因的Cf-2/Rcr3pim品系形成的根結最少，僅為101.3個/株;感病對照‘Hezuo903形成根結數為144.4個/株，抗病對照‘Tanaki的根結數僅為5.3個/株。Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3pim與感病和抗病對照相比均呈現顯著性差異（P<0.05）;而Cf-2/Rcr3-3品系與感病對照無顯著差異（P>0.05），與抗病對照相比則差異顯著（P<0.05）（圖2a）。

觀察并統計根系上的雌蟲數及卵塊數，均顯示與上述相類似的結果（圖2b，c），Cf-0/Rcr3pim、Cf-2/Rcr3-3和Cf-2/Rcr3pim根系上的平均雌蟲數分別為249.0、210.0和125.3個/株，卵塊數分別為134.6、110.0和71.3個/株，而感病對照‘Hezuo903的雌蟲數為196.7個/株，卵塊數為103.7個/株，抗病對照‘Tanaki根內雌蟲數僅為1.7個/株，無卵塊。Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3pim品系在雌蟲數及卵塊數上與感病和抗病對照相比均有顯著差異（P<0.05），而Cf-2/Rcr3-3品系僅與抗病對照差異顯著（P<0.05）。

番茄根系上單個卵塊的卵量統計結果（圖2d）顯示，Cf-0/Rcr3pim、Cf-2/Rcr3-3和Cf-2/Rcr3pim品系的單卵塊卵量分別為442.1、428.2粒和303.6粒，而感病對照‘Hezuo903的卵量高達448.2粒。Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3-3品系與感病對照相比均無顯著差異，而Cf-2/Rcr3pim品系與感病對照差異顯著（P<0.05）。

上述結果表明，與感病對照相比，Cf-2與Rcr3pim基因的分別在Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3-3品系中表達并未明顯影響南方根結線蟲的寄生，而兩種基因同時在Cf-2/Rcr3pim品系中表達能夠顯著減少南方根結線蟲在根系上的繁殖量。

2.3 Cf-2/Rcr3pim番茄材料的根結線蟲抗性評價

統計各番茄接種處理的根結率及根結指數，結果（表2）顯示，抗病對照‘Tanaki的根結率和根結指數最低，分別為1.79%和20.00，抗性評價為高抗（HR），感病對照‘Hezuo903的根結率和根結指數分別為50.25%和70.00，評價為中感（MS）。Cf-0/Rcr3pim、Cf-2/Rcr3-3和Cf-2/Rcr3pim品系的根結率分別為81.27%、56.45%和39.84%，根結指數均≥60.00，抗性評價分別為高感 （HS）、中感（MS）和感病（S）;3個番茄品系的根結率和根結指數與抗病對照相比均差異顯著，其中僅Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3pim品系與感病對照差異顯著（P<0.05）。

3 結論與討論

Cf-2/Rcr3pim基因對組合對番茄葉霉菌具有較好的抗性[14]，同時也能夠抑制致病疫霉Phytophthora infestans及馬鈴薯金線蟲的侵染[15， 22]。為了發掘根結線蟲的新抗源材料，本文通過室內人工接種法測定了Cf-2/Rcr3pim番茄不同品系對南方根結線蟲的抗性，所用品系包括Cf-2/Rcr3pim品系、Rcr3pim基因突變品系Cf-2/Rcr3-3以及雜交品系Cf-0/Rcr3pim[15]。結果證實：與分別表達Cf-2與Rcr3pim基因的Cf-2/Rcr3-3 和Cf-0/Rcr3pim品系相比，同時表達兩種基因的Cf-2/Rcr3pim品系根上的根結數、雌蟲數及卵塊數量明顯較少，表明該品系能夠一定程度上減少線蟲的侵染。Rcr3pim被認為是病原物侵染番茄的一類重要毒性靶標，當不存在Cf-2基因時，葉霉菌及馬鈴薯金線蟲能夠分別利用無毒蛋白Avr2和效應蛋白GrVAP1通過與Rcr3pim互作抑制植物的防衛反應進而促進侵染[15];本研究結果也同樣證實了僅表達Rcr3pim基因的Cf-0/Rcr3pim品系相比其他兩個品系對南方根結線蟲更為敏感，而Rcr3pim介導的不同病原物的毒性機制仍有待今后進一步深入研究。

為了進一步評估Cf-2/Rcr3pim番茄不同品系對南方根結線蟲的抗性，本文以‘Tanaki和 ‘Hezuo903兩個品種分別作為抗、感對照。‘Tanaki是表達Mi-1基因的商業化番茄品種，Mi-1基因對根結線蟲的抗性主要表現為產生過敏性壞死反應，導致根結線蟲侵入位點的細胞發生壞死，從而限制線蟲的取食，抑制其生長發育和繁殖[23]。而本文結果表明，雖然 Cf-2和Rcr3pim基因同時表達的Cf-2/Rcr3pim品系與其他兩個品系相比在一定程度上減少了成功侵染的線蟲數量，但并不能夠有效抑制線蟲的生長和發育，Cf-2/Rcr3pim品系的根結率及根結指數與感病對照‘Hezuo903相接近，仍為感病品種。此外，我們發現Cf-2/Rcr3pim番茄品系根系中侵入線蟲所產生的卵量明顯下降，比Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3-3番茄品系減少約30%，推測其原因可能是線蟲的侵染激活了Cf-2/Rcr3pim介導的番茄基礎防衛反應，在減少成功侵染的線蟲數量的同時，也對線蟲生長發育產生一定的影響，從而導致其產卵時間滯后或減少。

Cf-2/Rcr3pim番茄品系能夠抵抗葉霉病菌的侵染，本研究證實，Cf-2/Rcr3pim品系番茄對南方根結線蟲沒有抗性，不適用于根結線蟲的抗病育種。

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（責任編輯：楊明麗）

收稿日期： 20190315?? 修訂日期： 20190402

基金項目：國家自然科學基金（31872923）

致? 謝： 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學，特此一并致謝。

通信作者E-mail：lihm@njau.edu.cn

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