紫杉醇對肝癌細胞惡性生物學行為作用及其MicroRNA-544表達影響

文峰 楊俊 向燕

[摘要] 目的 研究紫杉醇對肝癌細胞惡性生物學行為作用及其MicroRNA-544表達的影響。方法 選取60只昆明小鼠隨機分為對照組、模型組和實驗組3組，每組20只，對照組為未處理小鼠，模型組為肝癌模型組，實驗組為肝癌模型紫杉醇干預組。檢測3組小鼠肝細胞或肝癌細胞不同培養周期MicroRNA-544的表達，以及模型組和實驗組小鼠肝癌細胞凋亡形態和凋亡率。結果 相同濃度紫杉醇不同作用時間對模型小鼠肝癌細胞的抑制無統計學差異，隨著紫杉醇濃度的提升，小鼠的抑癌率顯著升高（F組別=4.86，P<0.001）。對照組肝細胞不同培養時間MicroRNA-544表達量的差異無統計學意義（P>0.05）;模型組從第10周開始MicroRNA-544表達量顯著下降，第10～22周MicroRNA-544表達量相對穩定;實驗組加入紫杉醇開始培養（0周）時肝癌細胞的MicroRNA-544表達量與同期模型組比較差異無統計學意義（P>0.05），隨著培養時間的延長，實驗組的MicroRNA-544表達量顯著上調（F時間=65.37，P<0.001），并且實驗組的MicroRNA-544表達量明顯高于模型組（F組別=1.83，P<0.05）。與模型組相比較，實驗組G0/G1、S期細胞比例顯著下降，G2/M期細胞顯著上升（F周期=3.47，P<0.001;F組別=95.85，P<0.001），實驗組肝癌細胞的凋亡率顯著升高（F組別=66.32，P<0.001）。結論 紫杉醇可以抑制肝癌細胞增殖分化并提高其凋亡率，其機制可能與MicroRNA-544表達上調有關。

[關鍵詞] 紫杉酚;肝腫瘤;細胞增殖;微RNAs;昆明小鼠

[中圖分類號] R282.71;R735.7 ?[文獻標志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）02-0225-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.064 [開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.0915.007.html;2020-04-17 17：05

[ABSTRACT] Objective To investigate the effects of paclitaxel on the malignant biological behavior and MicroRNA-544 expression of hepatoma cells. ?Methods Sixty Kunming mice were randomly divided into control group （no intervention）， model group （establishing a mouse model of hepatocellular carcinoma）， and experimental group （establishing a model of hepatocellular carcinoma+paclitaxel intervention）， with 20 mice in each group. The MicroRNA-544 expression of the hepatocytes or hepatoma cells of the three groups was measured at different culture cycles. The apoptotic morphology and apoptosis rate of hepatoma cells were recorded in the model group and experimental group. ?Results The tumor inhibition rate of mice significantly increased with the concentration of paclitaxel （Fgroup=4.86，P<0.001）， but showed no significant differences between different durations of action of paclitaxel at a certain concentration. The control group exhibited no significant differences in the MicroRNA-544 expression of hepatocytes between different culture time points （P>0.05）. The model group displayed significantly decreased expression of MicroRNA-544 from week 10 and then a relatively stable expression level during weeks 10-22. Compared with the model group， the experimental group showed no significant difference in the MicroRNA-544 expression of hepatoma cells at the start of paclitaxel treatment （week 0） （P>0.05）; but the expression level in the experimental group significantly increased with the culture time （Ftime=65.37，P<0.001）， and significantly exceeded that in the model group （Fgroup=1.83，P<0.05）. Compared with the model group， the experimental group had significantly lower percentages of G0/G1-phase and S-phase cells and a significantly higher percentage of G2/M-phase cells （Fcycle=3.47，P<0.001;Fgroup=95.85，P<0.001）， as well as a significantly higher apoptosis rate of hepatoma cells （Fgroup=66.32，P<0.001）. ?Conclusion Paclitaxel can inhibit the proliferation and differentiation of hepatoma cells and improve the apoptosis rate， which may be related to the up-regulation of MicroRNA-544 expression.

[KEY WORDS] paclitaxel; liver neoplasms; cell proliferation; MicroRNAs; Kunming mice

肝癌是全球第三大癌癥相關性死因疾病，中國的肝癌病人約占世界的55%，且其發病率呈現逐年上升趨勢[1-3]。目前肝癌的治療主要采取手術治療，但手術后病人的生存率并不理想，對大多數病人特別是晚期病人術后的化療方案的選擇至關重要[4-6]。紫杉醇被認為是目前最為優秀的抗癌天然藥物，能夠顯著抑制多種癌細胞的生長增殖[6-9]，包括肝癌細胞 [10]，但對紫杉醇作用機制的相關研究并不多見。在肝癌進展的過程中，MicroRNA-544可以通過抑制肝癌細胞的增殖并促進其凋亡，進而抑制腫瘤的增殖和生長[11-12]。然而，紫杉醇的抗肝癌作用是否與MicroRNA-544有關系，目前尚未有相關研究報道。本研究將通過動物實驗探討紫杉醇對肝癌細胞惡性生物學行為和MicroRNA-544表達水平的影響，為紫杉醇抑癌作用機制提供理論依據。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理

本實驗選取6～8周齡KM小鼠（Kunming mice）60只，體質量為（20±2）g，雌雄均可，清潔級，購于中國醫學科學院實驗動物研究所。使用隨機數字表將以上小鼠分為A、B、C共3組，每組小鼠20只，置于室溫（21±2）℃、濕度30%～70%、光照每晝夜12 h的條件下飼養。實驗全程嚴格按照國家有關實驗動物的規定執行，本研究經醫院生物醫學研究倫理委員會批準。

本研究中，A組小鼠作為空白對照（對照組），不作任何處理。B組小鼠為肝癌模型組（模型組），用于建立肝癌動物模型。C組小鼠為紫杉醇加藥組（實驗組），在建立肝癌模型的基礎上進行紫杉醇干預。B、C組對入選小鼠進行二乙基亞硝胺腹腔注射，劑量為20 mg/kg，連續注射24周。小鼠肝臟穿刺活檢出現癌變肝細胞，則肝癌模型制備成功。采集各組小鼠肝臟（肝癌）組織，置-80 ℃冰箱冷凍保存。取各組小鼠凍存肝臟組織，置于37 ℃電熱恒溫水浴箱解凍后，將其培養于100 g/L的含FBS的高糖DMEM培養基中，恒溫細胞培養箱中傳代培養。A、B組培養細胞不予以干預。C組先用二甲基亞砜（DMSO）助溶劑將紫杉醇配制為10 mg/L的母液，再用無血清DMEM培養基將紫杉醇母液分別稀釋成20、40、80 μg/L的溶液，用含不同質量濃度紫杉醇的DMEM培養基進行傳代培養。

1.2 檢測指標和方法

1.2.1 紫杉醇對肝癌細胞最佳抑癌濃度 建模成功后，C組小鼠肝癌細胞用含20、40、80 μg/L紫杉醇的無血清DMEM培養基分別培養24、48、72 h后，再加入5 g/L細胞增殖能力檢測試劑（MTT）20 μL繼續培養4 h。培養結束后，棄去培養液，分別加入150 μL的DMSO溶液，震蕩10 min，充分溶解紫色結晶物之后，置于酶標儀檢測490 nm波長處吸光度。分別計算紫杉醇的半數抑癌濃度，確認最佳作用時間和濃度。抑癌率=（1-C組吸光度值/A組吸光度值）×100%[6]。

1.2.2 各組細胞不同培養周期MicroRNA-544表達檢測 對A組正常肝細胞及B、C組肝癌細胞連續培養22周，其中C組細胞培養按照紫杉醇最佳作用濃度加藥。分別對各組細胞培養開始（0周）和第10、18、22周細胞中MicroRNA-544的表達水平進行檢測。MicroRNA-544的表達采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）進行檢測，使用TRIzol試劑提取肝組織的RNA后，提取液中加入等量異丙醇，-80 ℃靜置30 min，使用體積分數0.85的乙醇進行洗滌，采用莖環法通過反轉錄手段獲得cDNA，以U6為內參，用PCR儀進行擴增，計算MicroRNA-544的相對表達量。

1.2.3 小鼠肝癌細胞增殖周期的檢測 分別對B、C兩組培養24 h后的肝癌細胞使用流式細胞儀進行細胞形態分析。對兩組的G2/M期細胞所占比例進行比較。

1.2.4 小鼠肝癌細胞凋亡率的檢測 將B、C兩組肝癌細胞制備成單細胞懸液，以3 500 r/min離心15 min后，加入100 μL的Binding buffer對細胞進行重懸。依次加入Annexin-V-FITC和PI染液，混勻后避光靜置15 min，再次加入450 μL的Binding buffer溶液進行混勻。采用流式細胞儀對凋亡細胞比率進行檢測。

1.3 統計學方法

所有數據均采用SPSS 20.0統計軟件進行分析。其中計量資料數據以±s表示，不同濃度紫杉醇、不同作用時間指標的比較采用析因設計的方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結 ?果

2.1 紫杉醇對模型小鼠肝癌細胞的最佳抑癌濃度

通過對相同濃度紫杉醇不同作用時間對模型小鼠肝癌細胞的抑制情況對比分析，當紫杉醇濃度為20、80 μg/L時，在不同作用時間其抑制率之間的差異存在統計學意義（F時間=45.71，P<0.001）。通過對相同作用時間紫杉醇不同作用濃度的抑癌情況進行分析，隨著紫杉醇濃度的提升，其對小鼠肝癌細胞的抑癌率顯著升高，差異存在統計學意義（F組別=4.86，P<0.001）。見表1。所以本研究以紫杉醇80 μg/L作為其抑癌有效濃度。

2.2 各組細胞不同培養周期MicroRNA-544表達水平比較

通過對各組細胞連續24周培養，對照組細胞不同培養時間的MicroRNA-544相對表達量之間的差異不存在統計學意義（P>0.05）。模型組隨著培養時間的延長，從第10周開始其MicroRNA-544表達量開始顯著下降（F組別=12.76，P<0.001），第10～22周MicroRNA-544的表達量相對穩定。實驗組在加入紫杉醇開始培養（0周）時肝癌細胞的MicroRNA-544表達量與同期模型組比較差異無統計學意義（P>0.05），隨著培養時間延長，實驗組的MicroRNA-544表達量顯著上調（F時間=65.37，P<0.001），且實驗組細胞的MicroRNA-544表達量明顯高于模型組（F組別=1.83，P<0.05）。見表2。

2.3 紫杉醇對小鼠肝癌細胞增殖周期的影響

通過對B、C兩組小鼠肝癌細胞凋亡形態檢測顯示，與模型組相比較，實驗組組小鼠的G0/G1、S期細胞比例下降，G2/M期細胞比例上升，差異存在統計學意義（F組別=95.85，P<0.001）。見表3。

2.4 紫杉醇對小鼠肝癌細胞凋亡率的影響

B、C兩組小鼠肝癌細胞凋亡率檢測結果表明，與模型組相比較，實驗組小鼠的正常肝細胞凋亡率差異無統計學意義（P>0.05），但肝癌細胞的凋亡率顯著升高，且差異存在統計學意義（F組別=66.32，P<0.001）。見表4。

3 討 ?論

目前肝癌的治療手段主要是手術治療，但多數肝癌病人就診時已處于中晚期，無法接受根治性手術，且術后也存在較高的復發率[13-14]。因此，化療成為肝癌的重要治療手段，尤其對中晚期肝癌具有重要臨床價值[15-17]。紫杉醇屬于中藥特色抗腫瘤類藥物，作為較為廣譜的化療藥物，已被全世界公認[18]。研究證實，紫杉醇能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，包括肺癌、卵巢癌、腎癌等[19]，特別是肝癌[20]。雖然紫杉醇已在臨床應用多年，但其對肝癌細胞惡性生物學行為影響的作用機制研究較少。

本研究通過肝癌動物模型對紫杉醇作用時間和濃度進行檢測，確定了紫杉醇的濃度為80 μg/L且作用時間24 h為其抑制肝癌細胞的最佳作用條件，并顯示紫杉醇對肝癌細胞的抑癌作用無劑量-時間交互效應。徐雅玲等[21]研究顯示，相同劑量不同作用時間的紫衫醇抑癌率之間不存在劑量效應關系，而不同劑量相同作用時間的紫杉醇抑癌率之間存在劑量-效應關系。這與本研究結果相互印證。

MicroRNA-544作為DLK1-DIO3印跡基因的重要minRNA，在多種腫瘤中可通過對癌細胞克隆能力的抑制，促進其凋亡;同時，MicroRNA-544還可通過對腫瘤干細胞自我更新能力的抑制作用，減低成球培養富集作用[22-24]。本文研究在肝癌細胞中紫杉醇是否影響MicroRNA-544的表達，結果顯示，紫杉醇能夠增加MicroRNA-544的表達，且隨著干預時間的延長，肝癌細胞MicroRNA-544表達水平顯著上升。

本文對肝癌細胞形態學的研究表明，紫杉醇能顯著改變腫瘤細胞的生長周期，促進腫瘤細胞的凋亡，對于肝癌細胞的增殖、分化等惡性生物學行為具有顯著的抑制性作用，其機制可能與紫杉醇能夠顯著抑制肝癌細胞的克隆能力有關。已有研究結果顯示，在肝癌組織中MicroRNA-544表達明顯下調，可抑制肝癌細胞的多種惡性生物學行為，促進肝癌細胞的凋亡[12，25]。這與本研究紫杉醇在肝癌細胞中的作用相同，如果把這兩個協調作用運用到臨床，對于病人的治療將具有積極的意義[26]。

綜上所述，紫杉醇可以抑制肝癌細胞增殖分化，并且能夠上調MicroRNA-544的表達水平，對于腫瘤細胞的抑制具有積極的作用。在以后的研究中，MicroRNA-544可能成為肝癌病人的治療靶點，可通過靶基因的相對表達量檢測，分析紫杉醇對病人的效應并對臨床預后進行預估。

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（本文編輯 于國藝）