組蛋白去乙酰化酶2在衰老心肌細胞自噬水平降低中的作用

王睿 王艷華 柴麗芬 吳琪瑞 吳凱 楊勇 楊曉玲 姜怡鄧李桂忠

寧夏醫科大學1基礎醫學院，2臨床醫學院，3國家衛生健康委員會代謝性心血管疾病研究重點實驗室（銀川750004）；4寧夏回族自治區人民醫院（銀川750004）

衰老是一個多步驟的細胞程序，具有穩定的細胞周期[1]，其已成為心血管疾病，糖尿病，癌癥等疾病的危險性因素[2-3]。細胞衰老則為與年齡相關的細胞固有功能的喪失，其亦為許多疾病的重要危險因子[4]，特別是心血管疾病。已有文獻[5]報道，心肌細胞衰老能夠引起心肌細胞水平的功能下降，導致心臟中能夠發揮正常功能的心肌細胞數目減少，對心臟功能產生消極影響。且相關研究[6]已證實，心肌細胞的衰老同時伴隨著細胞自噬水平的抑制。自噬是一種高度保守的真核降解過程，可將受損或不必要的蛋白質和細胞器輸送到溶酶體中進行降解，其在心血管疾病的發生和發展中起著重要的作用[7-8]。自噬的調節可能成為預防和控制心血管疾病的潛在靶標。然而，負責調節自噬的因素和控制自噬的方法目前尚不清楚[9]。組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDACs）是一類蛋白酶，能夠轉移組蛋白上的乙酰基集團，對染色體的結構修飾和基因表達調控發揮著重要作用。研究表明，高劑量硅酸鹽引起細胞自噬功能障礙，但是顯著降低和抑制HDACs 家族中的HDAC6 可以恢復自噬流量[10]。另外，HDACs家族中的另一成員HDAC2 被發現在心肌梗死小鼠模型中表達升高，進而導致心肌肥厚[11]，但其在衰老心肌細胞中的作用還未見報道。因此，本文擬從D-galactose 誘導的衰老心肌細胞角度出發，探討HDAC2是否參與了衰老心肌細胞自噬水平的降低。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑大鼠心肌細胞H9c2 購于中科院上海細胞生物學研究所細胞中心；超凈工作臺購于中國香港Heal Force公司；熒光定量基因擴增儀FTC-3000p 購于加拿大Funglyn Biotech公司；-80℃低溫冰箱購于美國Thermo Scientific公司；DMEM 培養基和胎牛血清購于美國Gibco公司；D-galactose 購于中國博奧拓達科技有限公司；小鼠來源抗p62抗體，兔來源抗LC3B抗體均購于美國Abcam公司；Cy3 偶聯的山羊來源抗兔抗體

購于美國Proteintech公司；兔來源抗HDAC2抗體購于美國CST（Cell Signaling Technology）公司；β-半乳糖苷酶染色試劑盒購于上海碧云天公司；總RNA 提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒、qRT-PCR檢測試劑盒均購于北京Takara公司；HDAC2 引物、內參（GAPDH）引物均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 正常心肌細胞的培養及衰老心肌細胞模型的復制在DMEM 純高糖培養基中加入10%胎牛血清及1%雙抗進行H9c2 正常心肌細胞的培養，細胞放置于含有5%CO2的37℃培養箱里，每2 天換液1次。當細胞密度達到80%左右時，使用含有EDTA的胰酶消化后傳代，添加培養液后繼續培養。使用含有8 mg/mL D-galactose的衰老培養液刺激H9c2 細胞9 d 之后（課題組前期已篩出D-半乳糖刺激的濃度及時間[12]），β-半乳糖苷酶染色驗證衰老心肌細胞模型是否復制成功。將正常H9c2 細胞組命名為control，將衰老心肌細胞組命名為D-galactose。

1.3 β-半乳糖苷酶染色鑒定細胞衰老情況Dgalactose 刺激H9c2 細胞衰老9 d 后，取出細胞，棄掉培養液，用PBS 緩沖液沖洗細胞1遍后，加入1×半乳糖苷酶染色固定液，室溫下孵育10～15 min，隨即用PBS 緩沖液清洗2遍，每遍3 min。再加入1 mL 半乳糖苷酶染色液，37℃培養箱中過夜，第2 天于普通光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 透射電鏡觀察心肌細胞的自噬結構前固定：心肌細胞從培養箱中取出后，吸凈培養液并用緩沖液清洗細胞兩遍，隨后加1.5 mL 固定液平放靜置15 min。用細胞刮小心輕柔的將細胞收集到1.5 mL 離心管中，1 000 轉離心10 min。棄上清，加入固定液后輕輕彈勻。4℃放置50 min后，1 000轉離心10 min 并棄上清，再加入固定液。重復3次上述過程，最終放入4℃保存。后固定：1%鋨酸浸泡1 h，0.1 M 二甲砷酸鈉緩沖液沖洗兩次。脫水：梯度酒精脫水后，環氧丙烷滲透。包埋：完全包埋液浸泡，制作超薄切片，透射電鏡下觀察。

1.5 Western Blot檢測自噬相關蛋白的表達改變分別取正常心肌細胞及D-galactose 誘導的衰老心肌細胞，胰酶消化后接種于25 cm2的透氣培養瓶中，每組各3 瓶。待細胞融合度達到80%時，使用全蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，12 000 轉離心15 min 后，收集上清即為全蛋白。采用BCA 法進行蛋白定量，經SDS-PAGE 電泳后，以恒流0.3 A，2 h為濕轉條件，轉至PVDF 膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，PBST 洗膜后一抗4℃孵育過夜。二抗室溫孵育2 h，加入顯色底物進行曝光，最終結果為目的條帶與β-actin的灰度值之比。

1.6 qRT-PCR檢測HDAC2的mRNA表達在6孔板中接種正常心肌細胞及衰老心肌細胞，每組3孔。按照總RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA，使用Takara的cDNA 第一鏈合成試劑盒逆轉錄為cDNA，采用Primer5.0 設計HDAC2 及GAPDH 引物（HDAC2 Forward：5′-GGGCTGCTTCAACCTAACTG-3′，Reverse：5′-TTCACAATCAAGGGCAACTG-3′；GAPDH Forward：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，Reverse：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′），以cDNA為模版，采用Takara qRT-PCR檢測試劑盒擴增HDAC2 基因。目的基因的相對量=2-△△Ct，△△Ct=[Ct（待測樣品）-Ct GAPDH（待測樣品）]-[Ct（校正樣品）-Ct GAPDH（校正樣品）]。

1.7 免疫熒光染色觀察自噬相關基因LC3B的表達細胞爬片用PBS 洗滌，用4%多聚甲醛固定30 min 后，PBS 沖洗干凈。H2O2處理10 min，PBS 洗凈。山羊血清封閉1 h，LC3B抗體（兔來源，1∶200稀釋液）4℃過夜，PBS 洗凈后將樣品與Cy3 偶聯的山羊抗兔IgG（1∶200 稀釋液）在37℃溫育1 h，隨后用PBS 洗滌3次。最后將細胞核用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復染5 min，通過激光共聚焦顯微鏡檢測熒光信號。

1.8 統計學方法用Prism 7.0 統計軟件進行統計學分析，結果以表示，計量資料兩組對比采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 衰老心肌細胞模型的建立H9c2 心肌細胞是貼壁細胞，細胞基本呈長梭形且包膜完整。心肌細胞經過D-半乳糖誘導9 d 后，通過β-半乳糖苷酶染色觀察衰老心肌細胞形態學的改變。未經衰老誘導的細胞染色結果呈陰性，而衰老誘導9 d的心肌細胞明顯呈現陽性（藍色），由此，衰老心肌細胞模型建立成功。見圖1。

圖1 衰老心肌細胞的培養及鑒定Fig.1 Culture and identification of aging cardiomyocytes

2.2 透射電鏡觀察衰老心肌細胞中的自噬結構透射電鏡結果顯示，正常心肌細胞中可見細胞器膜結構完整，多個自噬小泡包裹待降解底物形成自噬小體結構。而衰老誘導的心肌細胞中，線粒體數量明顯增多，少有自噬結構形成，自噬水平降低。見圖2。

圖2 電鏡觀察control與D-galactose組中自噬水平的改變Fig.2 The changes of autophagy levels in the control and Dgalactose groups was observed by electron microscopy

2.3 自噬相關基因在衰老心肌細胞中的表達采用Western Blot檢測control及D-galactose組中，LC3BⅡ與LC3BⅠ的比值，及p62的表達。衰老心肌細胞與正常心肌細胞相比，LC3BⅡ/Ⅰ明顯降低，p62表達水平明顯升高（P＜0.05），表明心肌細胞衰老后自噬水平降低。見圖3。

2.4 HDAC2的mRNA及蛋白表達采用qRTPCR及Western Blot 分別檢測control與D-galactose組中HDAC2的mRNA及蛋白表達情況，當正常心肌細胞給予衰老刺激后，HDAC2的mRNA 呈降低趨勢，蛋白表達也明顯降低，由此證實心肌細胞的衰老降低了HDAC2的表達情況。見圖4。

2.5 干擾HDAC2后檢測心肌細胞自噬水平的改變為進一步明確HDAC2在衰老心肌細胞自噬水平降低中的作用，將HDAC2 干擾病毒及對照病毒感染衰老心肌細胞后，Western Blot 首先驗證了病毒感染效率，隨后檢測了LC3B及p62的蛋白表達，最后通過免疫熒光染色觀察LC3B的表達情況。D-galactose組中的Ad-shHDAC2與Ad-shNC 相比，HDAC2 蛋白表達降低（P＜0.05），證實病毒感染成功。同時，干擾HDAC2 后LC3BⅡ/Ⅰ明顯降低，p62表達水平明顯升高（P＜0.05），與上述得出的HDAC2與自噬水平之間關系一致。LC3B 熒光強度更低，進一步證實了HDAC2的低表達能夠促進衰老心肌細胞自噬水平的降低。見圖5。

圖3 Control與D-galactose組中自噬相關基因的表達Fig.3 The expression of autophagy-related genes in control and D-galactose groups

圖4 control組與D-galactose組中HDAC2的mRNA及蛋白表達Fig.4 The mRNA and protein expressions of HDAC2 in control and D-galactose groups

2.6 H3K14ac的蛋白表達為探尋HDAC2在衰老心肌細胞自噬水平降低中的機制，采用Western Blot 檢測control 及D-galactose組中，H3K14ac的表達。如圖6A所示，衰老心肌細胞與正常心肌細胞相比，H3K14ac表達水平明顯升高（P＜0.05），表明心肌細胞衰老后H3K14的組蛋白乙酰化水平增加。為進一步證實HDAC2在其中發揮的作用，將HDAC2 干擾病毒及對照病毒感染衰老心肌細胞后，Western Blot 檢測了H3K14ac的蛋白表達。如圖6B所示，干擾HDAC2 后H3K14ac蛋白表達進一步增加，證實HDAC2在衰老心肌細胞中表達降低介導H3K14 高乙酰化水平。

3 討論

衰老通常以機體各項功能衰退為特征。在哺乳動物中，衰老發生于多個器官系統并導致其逐漸惡化，最終引起組織細胞功能障礙[13]。隨著老齡化社會的來臨，人民生存質量的提高及心血管疾病危險因素的廣泛流行，我國心血管疾病的發病率及病死率逐年增長，在年齡＞80歲的受試者中，心力衰竭發病率高達20%[14]，提示80歲以上的老年人是心血管疾病的高危人群。同時，心肌細胞隨著年齡增長受到越來越多的損傷，發展成為衰老心肌細胞后最終可能導致心肌細胞出現結構和功能的變化，因此深入探討老年心肌損傷成為亟待解決的重要課題。

圖5 感染HDAC2 干擾腺病毒后觀察自噬水平的改變。Fig.5 Changes in autophagy were observed after infection with Ad-shHDAC2

自噬是生物體內持續存在的一個動態的生物過程，衰老心肌細胞的自噬也參與了心血管疾病的發生發展[6]。臨床研究表明，心肌細胞的衰老與自噬水平改變之間存在密不可分的關系[15]，激活自噬可延緩心肌組織及細胞的衰老[16]。有文獻報道，自噬激動劑雷帕霉素可改善衰老引起的心肌細胞收縮功能障礙和線粒體吞噬功能的喪失[17]。但心肌細胞衰老與自噬之間究竟存在何種調控機制目前尚不清楚。本課題培養大鼠心肌細胞H9c2，并給予D-半乳糖誘導為衰老心肌細胞，進而比較正常與衰老心肌細胞中自噬水平的差異。透射電鏡可以清晰的看到，正常心肌細胞中線粒體結構完整，可見典型自噬結構存在，衰老心肌細胞中細胞膜及細胞器膜結構不完整。蛋白結果顯示，衰老心肌組比正常心肌組的LC3Ⅱ/Ⅰ水平明顯降低，p62水平明顯升高。已知LC3是自噬體膜上的標記蛋白，在細胞內以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種形式存在，伴隨著自噬的激活，LC3Ⅰ轉化為LC3Ⅱ并定位于自噬體膜，因此二者之比可以反映自噬水平的變化[18]。p62是選擇性自噬最重要的貨車蛋白，也被稱之為選擇性自噬受體，p62 結合泛素化蛋白進入到自噬體后最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而得到清除[19]。因此，本研究結果提示心肌細胞衰老同時伴隨著自噬水平的降低，這與已知文獻[18]報道一致。有關心肌細胞衰老引起自噬水平降低的可能解釋為，當心肌細胞衰老后，AMP 依賴性蛋白激酶（AMPK）活性被抑制，以及Ⅰ類磷脂酰肌醇3-激酶（PI-3K）/Akt 信號傳導通路被激活，導致雷帕霉素（mTOR）信號傳導的過度激活，自噬水平被抑制[20]，但其具體機制還有待進一步研究。

圖6 H3K14ac的蛋白表達Fig.6 The protein expression of H3K14ac

HDAC2 屬于HDACs 家族中的一員，其與組蛋白乙酰基轉移酶（HAT）共同作用使得組蛋白的去乙酰化與乙酰化水平處于動態平衡狀態。HDACs家族各成員主要定位于細胞核與細胞質中，另有少部分定位于胞質細胞器中，其在細胞的增殖，分化，凋亡中發揮重要的作用。在心血管系統疾病中，已證實HDACs 發揮了重要的調控作用。研究[21]表明，HDAC3是在破裂的動脈粥樣硬化病變中唯一上調的HDACs，HDAC3 敲除的巨噬細胞具有更強的脂質流出能力，因此，HDAC3 能夠促進脂質沉積進而增加斑塊的不穩定性。另有研究[22]報道，抑制HDAC2的活性能夠改善心臟肥大反應。以上證據為進一步探討HDAC2在衰老心肌細胞自噬改變中的作用提供了可能。在本研究中，8 mg/mL D-半乳糖刺激心肌細胞后，Western Blot 及qRT-PCR檢測HDAC2的蛋白及mRNA表達，均發現HDAC2的表達明顯降低，提示HDAC2可能在衰老心肌細胞自噬水平降低中發揮了重要的作用，但目前尚無相關文獻報道。為進一步明確HDAC2的作用效果，本研究構建了HDAC2的干擾腺病毒，轉染衰老心肌細胞發現，干擾HDAC2后的衰老心肌細胞自噬水平進一步降低，證實HDAC2 確實在衰老心肌細胞自噬水平降低中發揮了重要的作用，同時提示HDAC2 能夠促進衰老心肌細胞發生自噬。究竟有何種機制介導HDAC2促進心肌細胞衰老后自噬水平的升高呢？通過查閱有關文獻得知，香煙煙霧能夠降低小鼠肺細胞中的HDAC2的水平及活性，進而導致COPD患者肺部的持續炎癥，DNA 損傷和隨后的細胞衰老[23]，證實了HDAC2 參與調控了衰老細胞行為學的改變。另外，印苦楝內酯（Nimbolide）通過調控HDAC2介導的表觀遺傳學修飾進而影響乳腺癌中自噬水平的變化[24]。有趣的是，本研究也同樣發現在衰老心肌細胞中干擾HDAC2 后H3K14 乙酰化水平升高。由此筆者推測，HDAC2在衰老心肌細胞中表達降低介導H3K14 高乙酰化水平，使得乙酰化動態平衡被破壞，引起自噬相關基因表達降低，最終導致自噬水平的降低。

綜上所述，D-半乳糖能夠誘導H9c2 心肌細胞衰老，進而引起自噬水平的降低，與此同時，HDAC2 參與調控衰老心肌細胞自噬水平降低這一現象推斷并證實了組蛋白乙酰化可能在其中發揮重要作用，這一發現暫無其它文獻報道。并且有臨床證據表明[25]，與青年人相比，健康長壽老人中自噬相關蛋白Beclin1的水平較高，這也為本研究結果的準確性提供了臨床支持。但是，本研究目前僅局限于細胞水平，未來還需要獲取更多的實驗結果來證明其在動物水平中的作用，探尋其他引起衰老心肌細胞自噬水平降低的機制，為臨床應用提供更好的方案。