瞬時感受器電位-香草素受體4和轉化生長因子β1在牙齦瘤中的表達及意義

米會會 沈亞峰 孫斌 陶林 徐江

石河子大學醫學院第一附屬醫院（新疆石河子832000）

牙齦瘤是牙齦局限性慢性炎性增生[1]，具體發生機制不明。根據病理結構牙齦瘤常分為纖維性、肉芽腫性及血管性3型[2]。這種增生與牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGFs）、上皮細胞及細胞外基質增多有關。隨著我國高血壓患病率的增高，服用以鈣離子阻滯劑（calcium channel bockers，CCB）為降壓藥的患者逐漸增多，臨床中CCB 誘導的牙齦增生已居藥物性牙齦增生（drug-induced gingival overgrowth，DGO）首位[3]。

瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道是一種非選擇性陽離子通道，參與許多細胞病理生理學變化，與牙齦增生有密切聯系[4]。其中，瞬時感受器電位-香草素受體4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）是非選擇性能透過Ca2+、Na+等陽離子的發卡狀通道[5]。已有研究表明[4，6-7]TRPV4 廣泛表達于神經、血管、心臟和腎臟等組織。功能上可被溫度、剪切力、滲透壓等理化刺激激活，參與多種生理及病理過程[8-9]。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一種與炎癥和纖維化相關的因子，廣泛表達于心臟、肝臟、腎臟和牙齦等組織中，能夠促進牙齦成纖維細胞增殖和膠原纖維（Ⅰ型、Ⅲ型）的合成[10-11]。當前，TRPV4在牙齦瘤中的研究報道較少，本實驗通過免疫組織化學染色法探究TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤中表達與臨床病理參數的關系，以期為牙齦瘤發生、發展機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織標本選取石河子大學醫學院第一附屬醫院2010年10月至2018年10月手術切除的牙齦瘤存檔石蠟標本共148例（牙齦瘤組C組）；智齒冠周炎患者阻生齒拔除術后炎癥牙齦組織47例（炎癥牙齦組B組）；另選取29例于我院因美觀或修復等原因，行冠延長術患者牙齦組織（正常牙齦組A組）。牙齦瘤全部經病理確診并分型。其中纖維性、肉芽腫性各50例，血管性48例。牙齦瘤組中，男67例，女81例，平均（46.34±14.23）歲；炎癥牙齦組中，男22例，女25例，平均（39.25±12.42）歲；正常組男14例，女15例，平均（28.43±14.03）歲。入選者均知研究目的，及參加研究的潛在危險和利益，且簽署知情同意書。

服用硝苯地平的藥物性牙齦增生組納入標準[12]：（1）有高血壓病史且服用硝苯地平時間≥6個月；（2）伴有牙齦增生，上下頜前牙區嚴重；（3）需排除糖尿病等其他全身性疾病；（4）未同時服用苯妥英鈉、環孢素A 等其他引起牙齦增生的藥物；（5）近6個月未接受過牙周基礎治療；（6）手術前3個月內無抗生素服用史。

排除標準：（1）治療期間換用非鈣離子阻滯劑類降壓藥物者；（2）口服避孕藥者；（3）由非鈣詰抗類藥物（如苯妥英鈉、環孢素A）引起的牙齦增生者。

1.2 主要試劑TRPV4抗體購自英國abcam公司（ab94868），稀釋濃度1∶100；TGF-β1抗體購自Affinity公司（af1027），稀釋濃度1∶150；免疫組化試劑盒（封閉液、二抗、SAB 復合物以及DAB 顯色試劑）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法采用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法檢測。步驟：將牙齦組織標本固定包埋后切片，脫蠟后EDTA 修復抗原，3% H2O2孵育。BSA 處理后分別加入一抗覆蓋組織，以PBS為陰性對照4℃過夜后加入相應種屬的二抗，孵育漂洗后加入新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察控制顯色（陽性染色為棕黃色）。顯色完全后沖洗切片，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，氨水反藍。將干燥透明后的切片封固待觀察。

1.4 結果判定由2名病理科副主任醫師分別單盲法閱片。采用判定標準[13]：對每張切片的陽性細胞數比例及著色深淺進行計分，以細胞質及細胞膜內出現棕黃色至深棕黃色為陽性，根據著色的強弱程度和陽性細胞所占百分比進行評定和分析。積分數＝陽性染色細胞百分比評分×染色強度評分。陽性染色細胞百分比判定標準：每個標本都隨機選擇3個高倍視野（× 200），計數陽性細胞數占細胞總數的百分比（陽性細胞百分率）：＜5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4 分。染色強度判定標準為：無著色為0分；淡黃色為1分；黃色為2分；棕黃色為3分；棕褐色為4 分。陽等級：1～4為陰性（-）；5～8分為弱陽性（+）；9～12分為陽性（++）。以（+～++）為陽性，（-）為陰性。

1.5 統計學方法采用IBM SPSS 20.0 統計學軟件進行分析，計數資料比較采用χ2檢驗，行Spearman 相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TRPV4和TGF-β1在不同組織中的表達TRPV4和TGF-β1的在鱗狀上皮層中表達由深至淺依次為上皮基底層、棘層、顆粒層及固有層淺層細胞的細胞質中，在間質中主要表達于血管內皮細胞和成纖維細胞的細胞質和細胞膜上，呈淺黃色或棕色顆粒，少量表達于胞核中（圖1）。TRPV4在正常牙齦組織、炎癥牙齦組織及牙齦瘤組織中的陽性率分別為41.38%（12/29）、48.94%（23/47）和83.11%（123/148），結果差異有統計學意義（P＜0.01，表1）。TGF-β1在正常牙齦組織、炎癥牙齦組織及牙齦瘤組織中的陽性率分別為31.03%（9/29）、53.19%（25/47）和85.81%（127/148），差異有統計學意義（P＜0.01，圖2）。

2.2 TRPV4和TGF-β1表達與牙齦瘤臨床參數關系TRPV4表達與牙齦瘤患者年齡呈顯著相關（P＜0.05），且年齡越大，TRPV4表達越低。TGF-β1的表達在牙齦瘤患者年齡方面差異無統計學意義（P＞0.05）。TRPV4和TGF-β1在非藥物性牙齦增生的陽性率顯著高于藥物性牙齦增生，差異有統計學意義（均P＜0.001）。TRPV4和TGF-β1表達在性別、族別方面差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖1 TRPV4和TGF-β1在正常牙齦組織、炎癥牙齦組織和牙齦瘤組織中的表達（×200）Fig.1 Expression of TRPV4 and TGF-β1 in normal gingival tissue，inflammatory gingival tissue and epulis tissues（×200）

2.3 TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤病理分型中表達TRPV4和TGF-β1表達均與牙齦瘤病理分型相關（P＜0.05），且均以血管性牙齦瘤陽性率最高，分別為93.75%（45/48）和97.91%（47/48）。而TRPV4中陽性率最低的是肉芽腫性牙齦瘤，其陽性率為70%（35/50），纖維性陽性率為86%（43/50）；TGF-β1中陽性率最低則為纖維性，其陽性率為70%（35/50），肉芽腫性陽性率為90%（45/50）。見表3。

圖2 TRPV4與TGF-β1在不同牙齦組織中的表達Fig2 Expression of TRPV4 and TGF-β1 in different gingival tissues

2.4 TRPV4和TGF-β1表達的相關性牙齦瘤組織中TRPV4和TGF-β1的相關性。牙齦瘤組織中TRPV4和TGF-β1表達呈顯著正相關（r= 0.391，P＜0.001）。見表4。

3 討論

TRP 通道于1969年首次于果蠅的視覺系統中被發現[14]，為非選擇性陽離子通道，廣泛分布于多種生物中。其能被多種刺激激活，如機械牽張、溫度變化、氧化應激和炎性因子等[15]，進而激活下游相關陽離子通路，并參與細胞舒縮、增殖及分化等多種病理生理過程。而不同TRP通道對鈣離子、鎂離子、鈉離子、氫離子等的通透選擇性不同[16]。TRPV4 廣泛表達在神經、消化、呼吸、心血管等系統，可被溫度、剪切力、滲透壓等理化刺激激活[7-9]，可引起鈣離子、鈉離子的流動，并主要通過對鈣離子的調控及細胞內信號轉導通路，產生異構體等不同連接方式，影響細胞增殖、分化、遷移和凋亡等，進而在腫瘤的發生發展中發揮作用[17]。與正常組織細胞比，TRPV4在多數腫瘤細胞中高表達，如肝癌、肺鱗狀細胞癌、結直腸癌等[17]；極少數情況下呈低表達，如前列腺癌和食管癌[7]。TGF-β1是組織纖維化中的關鍵調節因子，它能通過激活下游的Smad 信號，從而促進血管形成、成纖維細胞增生、肌成纖維細胞分化、基質沉積、膠原合成等[18]，尤其在炎癥反應、纖維化、組織修復及胚胎發育以及免疫應答調節等病理、生理過程發揮重要作用。WRANA 等[19]研究TGF-β1 對HGFs的影響時發現TGF-β1 能促進細胞的增殖。此外，TGF-β1 能促進牙齦細胞增殖及組織修復。這些均提示TGF-β1能調節HGFs的增殖，影響牙齦組織的損傷與修復。

表2 分析TRPV4與TGF-β1在牙齦瘤中的表達與各臨床參數之間的關系Tab.2 Analysis of the relationship between the expression of TRPV4 and TGF-β1 in epulis and various clinical parameters

表3 TRPV4和TGF-β1表達與牙齦瘤病理分型關系Tab.3 Relationship between expression of TRPV4 and TGF-β1 and pathological typing of epulis

表4 牙齦瘤組織中TRPV4與TGF-β1的相關性Tab.4 Correlation between TRPV4 and TGF-β1 in epulis

TRPV4 已被證明在多種組織器官中有表達，但其在口腔中的表達及作用還未見文獻報道。如YAMADA 等[20]研究表明，TRPV4 高表達后刺激肝星狀細胞增殖，間接誘發肝癌。李孝瓊等[21]通過抑制TRPV4表達，能夠抑制宮頸癌HeLa 細胞（實驗用增殖表皮癌細胞）增殖，并推測TRPV4在宮頸癌HeLa 細胞異常增殖中可能具有負向調控作用。本研究中TRPV4 主要表達在牙齦上皮基底層細胞、內皮細胞和成纖維細胞的細胞膜及細胞質中。TRPV4在正常牙齦組織、炎癥牙齦組織及牙齦瘤中表達呈逐漸上升趨勢，在牙齦瘤中表達最高。因牙齦瘤是炎癥引起的瘤樣增生物，筆者推測TRPV4在牙齦瘤發生發展過程中起促進作用。

TGF-β1是由炎癥細胞和成纖維細胞等分泌的、與纖維化相關的細胞因子[22]，有研究表明，炎癥及細胞因子（如TGF-β1）在牙齦瘤的發生和發展中發揮著重要作用，這與本研究結果一致。本研究中TGF-β1在正常牙齦組織、炎癥牙齦組織和牙齦瘤三者中陽性表達率呈逐級上升趨勢，且TGF-β1 陽性率在牙齦瘤中較高為86.00%，表明TGF-β1 促進牙齦瘤的發生。

本研究發現TRPV4和TGF-β1表達均與牙齦瘤患者是否為藥物性牙齦增生顯著相關。TRPV4表達與牙齦瘤患者年齡相關，TGF-β1與之無關。本研究入選的藥物性牙齦增生患者以服用鈣離子阻滯劑的高血壓患者為主，國外資料顯示鈣通道阻滯劑引起藥物性牙齦增生患病率為15%～85%，國內學者報道為20%。鈣通道阻滯劑的藥理學機制是：作用于冠狀血管和周圍平滑肌細胞，且能夠選擇性阻滯細胞膜鈣通道，阻止鈣離子內流，減少細胞內可利用鈣離子。TRPV4是以鈣離子為主要透過性陽離子通道，推測鈣離子阻滯劑類藥物對該通道有抑制作用，從而導致TRPV4在在非藥物性牙齦增生中表達顯著高于藥物性牙齦增生，且差異有統計學意義，而藥物性牙齦增生以纖維性居多，本研究結果可為探索藥物性牙齦增生的發生機制提供新思路。而隨著老齡化社會的進入，高血壓患者逐漸增多，服用鈣離子阻滯劑的患者也逐漸增加，因此，當年齡越大，藥物性牙齦增生患者相對越多，則TRPV4表達就相對越低，恰與藥物性牙齦增生與非藥物性牙齦增生相比，表達較低結果一致。因此推論TRPV4對藥物性牙齦增生有部分抑制作用，對研究藥物性牙齦增生中纖維性增生較多有一定意義。

TRPV4主要表達于血管內皮細胞和Ⅱ型肺泡細胞中，少量表達于巨噬細胞、肥大細胞等炎細胞。研究表明，TGF-β1在口腔鱗癌中高表達，對鱗癌血管內皮細胞的增殖作用明顯，能夠促進腫瘤的形成和增長。而肉芽腫性牙齦瘤中以大量炎細胞及部分新生血管為主，血管性牙齦瘤則以大量成熟血管為主，伴少量炎細胞，纖維性牙齦瘤中以膠原纖維為主，伴少量血管及炎細胞。本研究發現TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤中表達呈正相關，且二者均高表達。因此，推測TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤的發生發展中起協同作用。

本研究通過免疫組化法分別檢測正常牙齦、炎癥牙齦、牙齦瘤組織中TRPV4和TGF-β1的表達，結果表明牙齦瘤組TRPV4和TGF-β1 明顯高于另外兩組，推測TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤的發生中起到一定調控作用。TRPV4和TGF-β1在藥物所致的牙齦增生中有一定作用，但TRPV4和TGFβ1 調控藥物性牙齦增生的具體作用機制還有待進一步探討。同時，TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤中均呈高表達，起協同作用。未來仍需要對TRPV4和TGF-β1在牙齦瘤的多層次不同方向進行研究。