深圳市耐多藥結核分枝桿菌耐藥基因突變特征分析

洪創躍 楊婷婷 李金莉 李霜君 吳利凱 楊爭 譚衛國

耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)是全球及我國主要的公共衛生問題之一。MDR-TB的治療需要多種藥品聯合，療程較長，制定的治療方案常因缺乏藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)檢測結果而導致治療失敗，增加患者的復發率[1]，因此，藥敏試驗對于MDR-TB患者的治療尤為重要。目前，作為金標準的表型藥敏試驗(drug susceptibility testing, DST)結果檢測時間長[2]，臨床醫生不能及時制定具有針對性的治療方案。而快速分子檢測方法(如GeneXpert MTB/RIF、GenoType MTBDRplus等)能夠解決DST耗時長的問題，已逐漸應用于臨床檢測中，但由于其目前只能檢測有限的耐藥突變，故只能選擇檢測已知耐藥突變頻率高的突變類型；另一方面，由于不同地區結核分枝桿菌菌株的基因型不同，其耐藥基因的突變類型和頻率也有差異，如katG基因突變在主要流行菌株為L3型的巴基斯坦地區是katG-463-R/L(66.7%)，而在主要流行菌株為L2型的北京則為katG-315-S/T(73.8%)[3-4]，故檢測本地區的耐藥突變類型，只能為當地的選擇提供基礎。隨著全基因組測序(whole-genome sequencing, WGS)技術的普及，基于全基因組序列數據分析可以同時檢測目前所有已知的對一線和二線抗結核藥品的耐藥突變，而且能夠獲得高于目前所有其他分子檢測方法的敏感度和特異度[5-7]，為評估現有分子技術檢測出的耐藥突變類型的代表性，全面分析一個地區耐藥突變類型，研發適合檢測本地區耐藥突變類型的分子技術提供依據。筆者利用2013—2017年深圳市MDR-MTB菌株全基因組測序數據，分析深圳市MDR-MTB菌株的耐藥基因突變類型和特點，以及主要突變類型與不同菌株基因型之間的相關性，旨在了解深圳市耐藥結核病的耐藥突變特點，為本地區耐藥結核病分子快速檢測方法的應用提供依據。

材料和方法

一、研究材料

收集2013—2017年深圳市慢性病防治中心及各區慢性病防治院門診診治的11 315例肺結核患者中，確診為MDR-TB的449例患者的結核分枝桿菌臨床分離株作為研究材料。

二、研究方法

1.WGS：由于本中心缺少測序設備，委托深圳聯合醫學科技有限公司對449株MDR-MTB臨床分離株進行測序，并于測序完成后返回測序原始數據。

2.WGS數據分析：通過對原始序列數據中基因突變的分析來獲得所需的相應的耐藥突變基因和突變位點。第一步，分別使用Scythe(https://github.com/ucdavisbioinformatics/scythe)和Sickle(https://github.com/najoshi/sickle)兩個軟件對449株菌株的測序數據進行接頭去除和低質量堿基處理(過濾Phred<20的堿基)。第二步，使用Bowtie2(http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2)軟件將處理過的高質量序列數據與結核分枝桿菌標準菌株(H37Rv)基因組模板序列(從美國國立衛生研究院維護的基因序列數據庫GenBank accession：NC_000962.3獲得)進行比對。第三步，根據比對結果，篩選出測序深度>10 X、基因組覆蓋度>95%[8]的測序數據樣本，本研究最終獲得平均深度為187X、覆蓋度為98.2%的447個滿足分析要求的全基因組測序數據。

3.單核苷酸多態性(SNP)鑒定：使用Samtools(http://www.htslib.org/)工具包鑒定每株菌株相比于H37Rv的SNP，將比對質量(mapping quality)最低值設定為30。再采用VarScan(http://varscan.sourceforge.net)軟件進一步鑒定和篩選出頻率≥75%，至少10條序列支持的SNP固定突變。

4.菌株分型和耐藥基因突變判定：將每株菌株鑒定后的全基因組SNP與H37Rv的各基因型和亞型的特異性突變(如L1，615938 G→A；L2，497491 G→A；L2.3, 1286766 G→C)進行比對，獲得各菌株獨屬的基因型或亞型[根據SNP的特異性突變，全球菌株的基因型可分為7種類型(L1～L7基因型)[9-10]]。將本研究檢測到的全基因組SNP與11種抗結核藥品(剔除掉所有患者治療中均未使用到的氯法齊明、利奈唑胺和貝達喹啉)的已知耐藥基因突變(從GenBank基因數據庫獲得)進行比對，獲得每株菌株的耐藥基因突變類型[11-12]，以耐藥基因是否發生突變作為判斷藥品敏感性的結果，以發現耐藥基因突變視為耐藥菌株，反之則為敏感菌株。11種藥品包括異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、吡嗪酰胺(PZA)、鏈霉素(Sm)、氧氟沙星(Ofx)、阿米卡星(Am)、卡那霉素(Km)、卷曲霉素(Cm)、乙硫異煙胺(Eto)、對氨基水楊酸(PAS)。

三、統計學處理

結 果

一、MDR-MTB臨床分離株耐藥基因突變情況

447株MDR-MTB臨床分離株的測序結果顯示432株(96.6%)發生基因突變。不同藥品的主要耐藥突變基因及突變類型的分布情況見表1。

1.432株MDR-MTB對一線抗結核藥品發生耐藥突變的基因：(1)INH：發生katG突變共計391株(90.5%)、inhA突變37株(8.6%)、oxyR-ahpC突變3株(0.7%)、kas基因突變1株(0.2%)。耐藥基因中共產生31種突變類型，其中最主要的突變類型為katG-315-S/T(81.7%,353/432)；此外，發現43株(10.0%,43/432)存在2個或多個位點聯合突變，以katG和inhA聯合突變居多(2.1%,9/432)。(2)RFP：均發生在rpoB基因耐藥決定區(rifam-picin-resistance determining region，RRDR)，共產生50種突變類型，最主要的突變類型為rpoB-450-S/L(59.7%,258/432)；且發現59株(13.7%,59/432)存在2個或多個位點的聯合突變。(3)EMB：主要為embB基因，主要位點分布在306(66.0%,175/265)、406(14.0%,37/265)、497(9.1%,24/265)、354(4.2%,11/265)等位點；同時在embA基因上也發現了突變位點的存在，主要在embA啟動子的-12(4.9%,13/265)、 -16(1.5%,4/265)位點。共產生31種突變類型，其突變類型以embB-306-M/V(35.5%,94/265)和embB-306-M/I(20.0%,53/265)最為常見，其中22株(8.3%,22/265)存在位點聯合突變。(4)PZA：主要為pncA基因及pncA啟動子區，共產生55種突變類型，其中突變頻率最高的是pncA啟動子-11-T/C(8.9%,11/123)。(5)Sm：主要為rrs和rpsL基因，共產生12種突變類型，其中最主要的突變類型為rpsL-43-K/R(66.0%,198/300)；另發現59株(19.7%,59/300)菌株中存在位點聯合突變。

2.對二線抗結核藥品發生耐藥突變的基因：(1)Ofx：主要在gyrA和gyrB基因上，但以gyrA(96.8%,120/124)基因突變為主，主要的突變類型為gyrA-90-A/V(31.5%,39/124)與gyrA-94-D/G(29.8%,37/124)。(2)Am、Km和Cm：主要為rrs基因，突變類型以rrs-1401-A/G(71.2%,79/111)為主，在Am、Km和Cm中分別占48.1%(25/52)、100.0%(27/27)、84.4%(27/32)。(3)Eto：主要發生在inhA基因，主要的耐藥突變類型為inhA-15-C/T(84.2%,48/57)。(4)PAS：主要在folC和thyA基因，主要的突變類型為folC-43-I/T(15.6%,5/32)與thyA-75-H/N(31.3%,10/32)。

表1 深圳市447株MDR-MTB臨床分離株對一、二線抗結核藥品的耐藥基因突變類型

續表1

注“其他”表示該種藥品中單個突變類型<5株的類型之和；表中英文縮寫分別為：A:丙氨酸；C：半胱氨酸；D：天冬氨酸；G：甘氨酸；H：組氨酸；I:異亮氨酸；K：賴氨酸；L：亮氨酸；N：天冬酰胺；M：甲硫氨酸；P：脯氨酸；Q：谷氨酰胺；R：精氨酸；S:絲氨酸；T：蘇氨酸；V: 纈氨酸；Y：酪氨酸；*：基因突變形成了終止密碼子，不編碼成氨基酸類型

二、MDR-MTB臨床分離株基因型

本研究僅獲得3個基因型，分別為L1型(0.4%,2/447)、L2型(84.6%,378/447)和L4型(15.0%,67/447)。其中，L2型菌株又分為3個亞型，分別為L2.1型菌株(1.9%，7/378)、L2.2型菌株[又稱“古老北京型”；37.0%(140/378)]和L2.3型菌株[又稱“現代北京型”；61.1%(231/378)]。

三、耐藥基因突變類型與耐藥基因型的相關性分析

由于本研究L1菌株(0.4%)及L2.1型菌株(1.9%)較少，故本結果僅分析L2.2型、L2.3型和L4型菌株與各藥品主要耐藥突變類型的相關性。結果顯示：(1)耐藥突變類型katG-315-S/T(INH)、embB-306-M/V(EMB)、rpsL-43-K/R(Sm)在L2基因型中的比例明顯高于L4型(P值均<0.05)；PAS中folC-43-I/T和thyA-75-H/N兩種突變類型僅在L2型菌株中出現。(2)L2.3型菌株中inhA-15-C/T(INH)、rpoB-450-S/L(RFP)、rpsL-43-K/R(Sm)和inhA-15-C/T(Eto)的突變率均明顯高于L2.2型菌株(χ2分別為4.319、5.668、16.053、12.797，P值均<0.05)，而katG-315-S/T(INH)的發生率則明顯低于L2.2型菌株(P=0.000)。(3)PAS中的thyA-75-H/N突變也僅在L2.2型菌株中發現，而在L4基因型未發現突變株數。具體見表2。

討 論

采用分子生物學方法檢測耐藥基因突變來預測結核分枝桿菌的藥品敏感性已獲得WHO的認可和推薦[13-14]，同時相關的研究證據也表明分子藥敏試驗具有較高的敏感度和特異度，且與DST的結果一致性超過85%[5-6,15]。但由于不同地區的結核分枝桿菌主要流行基因型不同，導致其耐藥突變類型和突變位點頻率不盡相同[3,16-19]；同時，目前用于臨床檢測的分子方法僅能檢測部分藥品或部分高頻耐藥突變基因[13,20-24]，如GeneXpert MTB/RIF僅檢測RFP的耐藥突變，而GenoType MTBDRplus僅檢測INH的katG和inhA基因，EMB僅檢測embB基因，而與耐藥相關的oxyR-ahpC和kasA(INH)、embA啟動子(EMB)并未涉及。

表2 深圳市MDR-TB臨床分離株對不同藥品主要突變類型在不同基因型中的分布情況

注括號外數值為“突變株數”，括號內數字為“突變率(%)”；突變株數包含表1中其他菌株類型中未顯示的菌株。a：為L2型中L2.2型與L2.3型的差異性比較；b：為L2型與L4型的差異性比較；SLID為包含Am、Km、Cm在內的二線抗結核藥品注射劑；耐PZA、PAS中主要突變數量較少，故不作分析

WGS方法相比較這些分子檢測方法具有可檢測所有已知耐藥突變類型的優勢，既可以對本地區耐藥突變特征進行全面分析，也可以評估本地區使用的分子檢測方法是否適用。例如本研究結果不僅檢測出所有已知的耐藥突變類型，還發現3株oxyR-ahpC和1株kasA(INH)、13株embA啟動子(EMB)突變的情況，若采用目前臨床使用的分子檢測方法則會產生漏診情況。另外，本研究還發現多種藥品(INH、RFP、EMB和Sm)存在兩種及以上耐藥突變情況，提示患者體內存在異質性耐藥[25]，可能導致臨床DST檢測同時出現耐藥和敏感的結果，對臨床醫生的診斷治療造成困惑。既往研究顯示，目前的分子檢測方法的敏感度僅能檢測到高于20%的耐藥亞群[26]，這可能也是多種分子檢測方法研究未見異質性耐藥報道的原因之一[3-4,27]。而本研究采用WGS方法發現了比例不低的異質性突變情況，且檢查出來的耐藥亞群均低于20%，進一步說明WGS相比較其他分子檢測方法具有更大的優勢。

不同地區的耐藥突變譜不同，可能與不同地區的不同流行基因型菌株差異有關[3,16-19]。本研究中深圳地區主要以L2型和L4型基因型為主，其中L2基因型菌株超過80%，是最主要的流行基因型；同時發現L2型菌株中katG-315-S/T(INH，81.7%)、embB-306-M/V(EMB)、rpsL-43-K/R(Sm)突變頻率最高，與katG-315-S/T在主要流行L3型的印度地區(62.6%)[16]和主要流行L4型的墨西哥地區(60.0%)[18]的研究結果存在差異，也與同樣流行L2基因型的北京(73.8%)[4]和上海(66.3%)[5]不同，這一結果進一步說明了解本地區耐藥突變分布情況的重要性。EMB耐藥菌株中則出現了突變位點相同但突變類型不同的情況，如在主要流行L3型的巴基斯坦地區，突變類型為embB-306-M/I占20%[19]；而本研究在深圳市L2流行為主的情況下，突變類型為embB-306-M/V占比較大(35.5%)，與上海地區相似(embB-306-M/V，36.2%)[5]，但較北京地區低(embB-306-M/V，62.5%)[4]。研究還發現，PAS的folC-43-I/T、thyA-75-H/N兩種突變類型僅出現在L2型菌株中，與已報道的研究相同[28]；Am的rrs基因中出現514和517位點的突變情況，這種突變暫時未見其他耐藥研究報道[2,5,7,29]，是否與其耐藥性存在相關性仍需進一步深入研究；同時，檢測到Am的2個耐藥基因突變位點，可能是本研究中Am的耐藥率高于Km的原因。因此，不同地區突變類型和基因型存在的這些差異，使得同一種分子檢測方法檢測敏感度也存在差異。例如巴基斯坦地區使用GenoType MTBDRplus檢測INH、RFP的敏感度分別為71.7%、79.2%[3]；而巴西地區、中國北京也采用同樣方法，其檢測敏感度分別為83.3%、93.3%[27]和82.1%、98.7%[4]。因此，采用WGS對本地區進行耐藥突變特征分析，可以了解本地區耐藥突變分布情況，進而針對相應突變類型設計對應的突變位點，對提高分子檢測方法的敏感度、避免漏診耐藥患者、更好地指導臨床用藥具有重要意義。

綜上所述，本研究揭示了深圳市MDR-MTB菌株主要耐藥突變類型，以及突變類型與菌株基因型的相關性，為研發新的耐藥結核病分子檢測方法選擇耐藥突變位點提供了數據支持，為提高分子耐藥檢測敏感度、精準指導臨床用藥提供理論參考。